肖志娟 趙志敏 鄒玉安 薛 茜 邢立強

缺血性腦血管病（ICVD）是中老年人的常見病， 約占全部腦血管病(VCD)的80%，是人類的第三大致死病因。因此，ICVD的防治非常重要。Pi3k/akt通路是體內重要的信號轉導通路。1999年Kitagawa等[1]首次報道腦缺血可激活Pi3K/akt信號通路，近年來，不少研究證實Pi3k/akt通路可對腦缺血產生的保護作用[2-3]。本研究制作大鼠腦缺血再灌注模型，觀察康腦液對模型大鼠神經(jīng)功能的影響，探討其可能作用機制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。SPF級雄性SD大鼠180只，體質量（270±20）g，購自北京大學醫(yī)學部動物中心，許可證號：SCXK(京)2011-0012。（2）藥品與試劑。尼莫地平：河北永豐藥業(yè)有限公司生產(國藥準字H13021882,規(guī)格20 mg)；康腦液：黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤(后下)、三七粉等組成(購于河北北方學院第一附屬醫(yī)院)。三七粉除外，所有藥材用冷水浸泡30 min，水位超過藥約5 cm為宜。先用武火煮沸，再改用文火慢煎10～20 min，每劑中藥共煎煮3次，過濾出藥渣，將3次煎煮的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%的康腦液(每mL含生藥量4 g、2 g、1 g)，存放于4℃冰箱備用。栓線購自北京沙東生物技術有限公司(產品編號2432-A4)，Pi3k、Akt原位雜交試劑盒購買于武漢博士德公司。（3）主要實驗儀器。電腦生物組織包埋機、電腦生物組織攤烤片機(浙江金華科迪)，石蠟切片機、自動脫水機(美國Thermo)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS CX21型)，顯微攝影裝置(日本NIKON)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為假手術組，模型組，康腦液高、中、低劑量組和尼莫地平組。各組大鼠實驗前7 d開始灌胃給藥，術后12 h繼續(xù)給藥，每日1次，直至處死。給藥劑量按鼠與人體表面積等效劑量折算，康腦液高、中、低劑量組分別為24、12、6 g/(kg·d)，尼莫地平組劑量為1 mg/(kg·d)，假手術組及模型組灌胃等體積蒸餾水。

1.2.2 制備模型 根據(jù)改良Longa方法，線栓經(jīng)右側頸外動脈插線建立右側大腦中動脈阻塞(MCAO)法制作大腦缺血再灌注（I/R）模型，假手術組除不穿線外，其余操作同模型組及治療組。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能評分 參照Longa建立的神經(jīng)功能缺損程度的五級四分法評分標準對大鼠進行評分，分別于造模大鼠蘇醒時及I/R 24 h后進行評分：0分，不出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)；1分，病灶對側前爪不能充分伸展；2分，行走時向外側轉圈；3分，行走時向對側傾斜；4分，不能行走，意識喪失。評分1～3分的大鼠符合模型成功的標準，不符合者剔除。

1.2.4 原位雜交技術檢測Pi3k和Akt mRNA 分別于再灌注12、24、48、72、168 h，每組取6只大鼠，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室插管至升主動脈，同時剪開右心房，依次灌入生理鹽水約200 mL、4%多聚甲醛約200 mL前固定至肢體變硬，開顱取腦，于前囟前2 mm至前囟后3 mm切腦，切塊厚度5 mm，迅速置入0.1%DEPC處理的4%多聚甲醛中后固定2～4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片5 μm。用原位雜交方法（按說明操作），檢測腦組織Pi3k和Akt mRNA表達。光鏡下在梗死周邊區(qū)隨機讀取6個互不重疊視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)。

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 與模型組比較，康腦液各劑量組、尼莫地平組神經(jīng)功能評分明顯降低(P＜0.05)；與尼莫地平組比較，康腦液高、中劑量組神經(jīng)功能評分降低(P＜0.05)，見表1。

Table 1 Neurological scores of different times ofcerebral I/R in rats表1 各組I/R大鼠不同時間神經(jīng)功能評分（n=30，分±s）

Table 1 Neurological scores of different times ofcerebral I/R in rats表1 各組I/R大鼠不同時間神經(jīng)功能評分（n=30，分±s）

＊＊P＜0.01；a與(2)比較,b與(6)比較,P＜0.05

組別假手術組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F大鼠蘇醒時-2.03±0.61 1.47±0.51ab 1.50±0.51ab 1.77±0.43a 1.73±0.45a 6.177＊＊再灌注24 h -2.27±0.52 1.50±0.51ab 1.57±0.50ab 1.93±0.52a 1.87±0.57a 10.338＊＊

2.2 腦組織Pi3k mRNA與Akt mRNA原位雜交結果 見表2、3，圖1、2。Pi3k mRNA與Akt mRNA陽性表達可見胞漿呈棕黃色，與假手術組相比，模型組Pi3k mRNA與Akt mRNA表達各時間點明顯增高(P＜0.05)。與模型組比較，康腦液各劑量組、尼莫地平組Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達各時間點明顯增高(P＜0.05)；尼莫地平組Pi3k mRNA與Akt mRNA表達低于康腦液高、中劑量組(P＜0.05)。

Table 2 Comparison of Pi3k mRNA expression level in cerebral tissue between six groups表2 各組大鼠腦組織Pi3k mRNA的比較(n=6，個數(shù)/視野，±s)

Table 2 Comparison of Pi3k mRNA expression level in cerebral tissue between six groups表2 各組大鼠腦組織Pi3k mRNA的比較(n=6，個數(shù)/視野，±s)

＊＊P＜0.01；a與(1)比較，b與(2)比較，c與(6)比較,P＜0.05，表3同

3.83±0.98 18.17±0.75a 25.67±0.52bc 25.33±0.82bc 22.33±0.52b 22.67±0.82b 714.000＊＊3.33±1.03 21.83±0.75a 29.17±1.33bc 28.83±0.98bc 24.83±0.98b 25.33±0.82b 558.444＊＊組別假手術組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F 48 h 2.83±0.75 18.33±0.52a 31.50±1.22bc 31.67±0.82bc 26.83±0.98b 27.50±0.84b 942.229＊＊72 h 2.17±0.75 16.17±0.41a 40.00±0.63bc 39.83±0.75bc 31.17±1.33b 32.00±1.10b 1712.629＊＊168 h 2.17±0.75 13.83±0.75a 37.17±0.75bc 37.17±0.75bc 30.00±0.63b 30.83±0.75b 1983.459＊＊

Table 3 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups表3 各組大鼠腦組織Akt mRNA的比較(n=6，個數(shù)/視野，±s)

Table 3 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups表3 各組大鼠腦組織Akt mRNA的比較(n=6，個數(shù)/視野，±s)

組別假手術組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F 12 h 4.00±0.89 13.67±1.21a 27.17±0.75bc 26.67±1.03bc 21.83±1.17b 23.00±0.89b 477.143＊＊24 h 3.67±0.82 17.00±1.26a 32.00±1.10bc 32.00±0.63bc 25.50±0.84b 26.17±0.75b 824.156＊＊組別假手術組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F 48 h 3.50±0.84 20.17±0.75a 36.50±1.05bc 36.67±0.52bc 26.50±0.55b 27.00±0.89b 1 466.107＊＊72 h 3.33±1.03 22.83±0.75a 39.00±0.89bc 38.67±0.82bc 30.00±0.63b 30.33±1.03b 1 382.577＊＊168 h 3.17±0.75 19.33±0.82a 35.83±0.75bc 35.67±0.52bc 28.00±0.63b 28.67±0.82b 1 751.702＊＊

Figure 1 Comparison of Pi3k mRNA expression in cerebral tissue between six groups(In situ hybridization，×400)圖1 大鼠腦組織Pi3k mRNA的表達(原位雜交，×400)

Figure 2 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups(In situ hybridization,×400)圖2 大鼠腦組織Akt mRNA的表達(原位雜交，×400)

3 討論

ICVD的發(fā)病基礎是腦組織缺血而導致相應神經(jīng)功能缺損，其治療關鍵無疑是改善缺血區(qū)的血供，促進神經(jīng)功能恢復。有研究表明保證缺血區(qū)血流灌注可加速卒中后突觸的可塑性和功能的恢復[4]。臨床上超早期行重組組織型纖溶酶原激活劑(r-tPA)溶栓對ICVD的療效，證實了盡快恢復缺血區(qū)的血供，可減輕神經(jīng)功能的損害。

Pi3k/akt通路是細胞內一條重要的信號轉導通路，參與細胞生長、增殖等多種生物學行為的信號轉導。Pi3k是磷脂激酶家族中的重要成員，由催化亞單位P110和調節(jié)亞單位P85組成異源二聚體，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性。Akt屬絲/蘇氨酸激酶家族，是Pi3k信號轉導途徑中一個重要的下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性。生長因子與細胞膜受體結合后激活Pi3k，進而激活下游蛋白如Akt,最終活化和上調cyclinD1，引起細胞增殖[5]。于惠賢等[6]研究表明Pi3k/akt通路的磷酸化參與血管新生，增加腦缺血區(qū)微血管密度，從而改善大腦血液循環(huán)，達到腦保護的作用。周賽君等[7]研究表明高糖可經(jīng)上調猴視網(wǎng)膜血管內皮細胞RF/6A細胞內Pi3k/akt信號通路促進血管新生。另外內皮祖細胞的遷移也與Pi3k/akt通路有關[8-9]。且早有研究表明Pi3k/akt通路是促進細胞存活的重要信號轉導通路[10]，Pi3k通過3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)磷酸化Akt使其活性增強，影響下游凋亡相關蛋白如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)等,發(fā)揮抗凋亡等作用[11]，保護神經(jīng)元。本研究顯示Pi3k/akt通路在I/R大鼠神經(jīng)功能恢復中起到十分重要的作用。

康腦液由補陽還五湯化裁而來，具有益氣活血化瘀、清熱平肝、熄風定驚的作用。諸多研究已證實益氣活血化瘀通絡法治療腦梗死具有明確療效[12-13]。本研究結果表明康腦液治療組，尤其高、中劑量治療組I/R大鼠的神經(jīng)功能明顯改善。與假手術組相比，模型組Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達明顯增高，表明缺血影響了Pi3k/akt通路，對腦卒中的恢復起到一定作用，但用藥組較模型組更進一步提高了Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達，且康腦液高、中劑量治療組Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達明顯增高，說明康腦液治療ICVD的可能機制之一是通過上調Pi3k/akt信號轉導通路的表達。

[1]Kitagawa H,Warita H,Sasaki C,et al.Immunoreactive Akt,PI3-K and ERK protein kinase expression in ischemic rat brain[J].Neuro?sci Lett,1999,274(1):45-48.

[2]Yuan Y,Guo Q,Ye Z,et al.Ischemic postconditioning protects brain from ischemia/reperfution injury by attenuating endoplasmic reticu?lum stress-inducted apoptosis through PI3K-AKT pathway[J].Brain Res,2011,1367:85-93.

[3]邢變枝,陳暉,張?zhí)K明.缺血后處理對腦缺血再灌注損傷后ERK2/ 1和Akt磷酸化及神經(jīng)細胞凋亡的影響[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2012,7(3):175-179.

[4]Mostany R,Chowdhury TG,Johnston DG,et al.Local hemodynamics dictate long-term dendritic plasticity in peri-infarct cortex[J].J Neurosci,2010,30(42):14116-14126.

[5] Namkoong S,Kim CK,Cho YL,et al.Forskolin increases angiogen?esis through the coordinated cross-talk of PKA-dependent VEGF expression and Epac-mediated PI3K/Akt/eNOS signa-ling[J].Cell Signal,2009,21(6):906-915.

[6]于惠賢,胡永善,賈杰,等.運動訓練調節(jié)Tie-2/PI3K/AKT通路促進腦缺血大鼠缺血區(qū)血管新生[J].中國運動醫(yī)學雜志,2009,28(5): 518-521.

[7] 周賽君,于珮,于德民.高糖對RF/6A細胞內PI3K-Akt信號通路的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2012,6(4):928-931.

[8]秦剛,陳永強.內皮祖細胞遷移與PI3K/Akt信號轉導通路[J].國際骨科學雜志,2010,31(4):207-209.

[9] Madeddu P,Kraenkel N,Barcelos LS,et al.Phosphoinositide 3-ki?nase gamma gene knockout impairs postischemic neovasculariza?tion and endothelial progenitor cell functions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(1):68-76.

[10]Choi JS,Park HJ,Kim HY,et al.Phosphorylation of PTEN and Akt in astrocytes of the rat hippocampus following transient forebrain ische-mia[J].Cell Tissue Res,2005,319(3):359-366.

[11]Bassili M,Birman E,Schor NF,et al.Differential roles of Trk and p75 receptors in tumorigenesis and chemoresistanceex vivoandin vi?vo[J].Cancer Chemother Pharmacol,2010,65(6):1047-1056.

[12]趙軍,趙麗艷,張晉,等.益氣活血化痰通絡法治療急性腦梗死64例[J].中國中醫(yī)急癥,2011,20(12):1912-1913.

[13]雷蕊娥,康健.益氣活血化痰通絡湯治療急性腦梗死64例療效分析[J].航空航天醫(yī)學雜志,2012,23(6):766-767.