顧玲佳，倪連松

（1.臺州市第一人民醫(yī)院 內分泌科，浙江 臺州 318020；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 內分泌科，浙江 溫州 325015）

法舒地爾對高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞增殖和纖維化的影響

顧玲佳1，倪連松2

（1.臺州市第一人民醫(yī)院 內分泌科，浙江 臺州 318020；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 內分泌科，浙江 溫州 325015）

目的：探討法舒地爾（Fasudil）對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞（HK-2）增殖和纖維化的影響。方法：將HK-2細胞分為正常對照組（NG組，葡萄糖濃度5.5 mmol/L）、高張組（HM組，葡萄糖濃度5.5 mmol/L+甘露醇54.5 mmol/L）、高糖組（HG組，葡萄糖濃度60 mmol/L）、高糖+小劑量法舒地爾干預組[FA（5）組，D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地爾5μmol/L]、高糖+中劑量法舒地爾干預組[FA（10）組，D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地爾10μmol/L]；⑥高糖+大劑量法舒地爾干預組[FA（20）組，D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地爾20μmol/ L]。四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定HK-2細胞增殖；免疫共沉淀法檢測p-MYPT1-Thr853；Western印跡法檢測結締組織生長因子（CTGF）的表達；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液轉化生長因子β1（TGF-β1）和纖維連接蛋白（Fn）的含量。結果：與NG組比，HG組HK-2細胞出現(xiàn)增殖增加，p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表達增加。與HG組比，F(xiàn)A（5）組、FA（10）組、FA（20）組均抑制了HK-2細胞的過度增殖，p-MYPT1-Thr853、TGF-β1、CTGF和Fn的表達均減少。結論：法舒地爾可能通過抑制Rho激酶活性抑制高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞增殖和纖維化。

法舒地爾；腎小管上皮細胞；纖維化；糖尿病腎病

近年來，隨著對RhoA/ROCK信號通路研究的加深，該信號通路在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）中的作用引起了人們的高度重視。法舒地爾（Fasudil）是目前在臨床中最常用的ROCK抑制劑。但是，目前ROCK信號通路在DN中的研究主要集中在腎小球和系膜細胞。因此，我們以高糖模擬糖尿病條件，以不同濃度的法舒地爾作干預實驗，觀察法舒地爾對高糖培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞（human renal tubular epithelial cells，HK-2）增殖和纖維化的影響，以評估法舒地爾在DN防治中的作用，并為其進一步的臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑及儀器 HK-2細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號：GDC152。鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司（產品批號：091114）；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT購自美國Sigma公司；鼠抗人結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、ROCK抗體及兔抗人p-MYPT1-Thr853購自美國Cell Signaling公司；免疫共沉淀試劑盒、HRP標記二抗購自江蘇碧云天生物技術研究所；Fn ELISA試劑盒購自上海西唐公司產品；酶標儀為Thermo公司產品，Imaglab凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產品。

1.2 HK-2細胞培養(yǎng)及分組 HK-2細胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的低糖（5.5 mmol/L D-葡萄糖）DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。為了誘導纖維化，HK-2細胞在60 mmol/L高糖條件下培養(yǎng)24、48、72 h，該葡萄糖濃度是通過預實驗得到，時間選擇參考文獻[7]。

將HK-2細胞分為6組：①正常對照組（NG組，D-葡萄糖5.5 mmol/L）；②高張組（HM組，D-葡萄糖5.5 mmol/L+甘露醇54.5 mmol/L）；③高糖組（HG組，D-葡萄糖60 mmol/L）；④高糖+小劑量法舒地爾干預組[FA（5）組，D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地爾5 μmol/L]；⑤高糖+中劑量法舒地爾干預組[FA（10）組，D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地爾10μmol/L]；⑥高糖+大劑量法舒地爾干預組[FA（20）組，D-葡萄糖60 mmol/L+法舒地爾20μmol/L]。

1.3 MTT法檢測HK-2細胞增殖 收集對數生長期細胞消化后制成細胞懸液，按2×104/mL接種于96孔板中，細胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，按實驗分組換為不同的培養(yǎng)液，設6個復孔/組，培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)終止前4 h每孔加入MTT（5 mg/ mL）20μL繼續(xù)孵育4 h，然后棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150μL終止反應，震蕩混勻使結晶物充分溶解。在酶標儀波長490 nm處測量各孔的吸光值（OD值）。加法舒地爾組在實驗前均用錐蟲藍染色觀察，活細胞數均大于95%，排除法舒地爾的細胞毒性作用。

1.4 免疫共沉淀法檢測HK-2細胞ROCK活性 HK-2細胞接種在10 cm細胞培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)貼壁生長至100%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，按實驗分組換為不同的培養(yǎng)液。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，HK-2細胞在60 mmol/L的高糖中培養(yǎng)12 h后p-MYPT1-Thr853蛋白表達最多，故我們選擇培養(yǎng)12 h。12 h后終止培養(yǎng)，裂解細胞后，收集裂解液于4 ℃，17 949×g離心30 min后收集上清，取50μL上清用于檢測總ROCK的表達并作為內參照，余上清加入10μL p-MYPT1-Thr853的一抗，4 ℃搖床過夜，再加入充分混勻的蛋白A+G瓊脂糖4 ℃搖床2 h以沉淀免疫復合物，用預冷的PBS洗滌沉淀3次，完成最后一次洗滌后，去除上清，加入1×SDSPAGE電泳上樣緩沖液。變性后取50μL樣本行10% SDS-PAGE電泳，Western印跡法檢測p-MYPT1-Thr853的表達。Imagelab軟件分析結果，以所測得的各條帶的吸光度（integrated absorbance，IA）與相應總ROCK的IA的比值作為ROCK活性值。

1.5 Western印跡法檢測HK-2細胞CTGF的表達 HK-2細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)貼壁生長至70%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，按實驗分組換為不同的培養(yǎng)液。72 h后終止培養(yǎng)，裂解細胞后，收集裂解液于4 ℃，17 949×g離心30 min，取上清用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，操作按說明書。5×（5倍濃縮）蛋白上樣緩沖液變性蛋白。取總蛋白60μg上樣，用10%的SDSPAGE凝膠進行電泳后，恒流將蛋白轉印至PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST室溫搖床封閉2 h，加入一抗：小鼠抗人CTGF（1∶200）、β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后分別加入相應的HRP標記的二抗（1∶1 000），室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜后分別取等量ECL試劑盒溶液A和B液，混合后加于PVDF膜，避光反應1 min，Bio-Rad公司Molecular Imager ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)自動曝光掃描并用Imagelab軟件對條帶進行分析，以所測得的各條帶的吸光度與內參照β-actin的吸光度的比值作為最終結果進行統(tǒng)計分析。

1.6 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）含量 收集培養(yǎng)24、48、72 h細胞上清液于4 ℃，4 142×g離心3 min后用ELISA法檢測Fn，具體操作參見試劑盒說明書。收集細胞冰上裂解后離心，收集上清用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，操作按說明書進行，以矯正ELISA法檢測結果。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數據用±s表示，組間差異用單因素方差分析，有顯著差異者用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞增殖的影響

與NG組比，HG組的OD值顯著增大（P＜0.01），提示高糖可明顯促進HK-2細胞增殖。與HG組比，3個不同濃度的高糖+法舒地爾組的OD值均顯著下降（均P＜0.01），且與法舒地爾呈濃度依賴性，提示法舒地爾可明顯抑制高糖的促增殖作用。見表1。

表1 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞增殖的影響（n=6，±s）

表1 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞增殖的影響（n=6，±s）

與NG組比：aP＜0.01；與HG組比：bP＜0.01

組別 OD值NG組0.65±0.02 HM組0.64±0.05 HG組0.81±0.03aFA（5）組0.76±0.02abFA（10）組0.71±0.02abFA（20）組0.66±0.02b

2.2 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞ROCK活性的影響 圖1顯示，與NG組比較，HG組HK-2細胞p-MYPT1-853蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HM組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，高糖+法舒地爾干預組p-MYPT1-853蛋白表達均減少（均P＜0.01），且與法舒地爾呈濃度依賴性，提示法舒地爾可以抑制高糖培養(yǎng)的HK-2細胞ROCK活性。

圖1 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞ROCK活性的影響

2.3 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞TGF-β1、CTGF、Fn表達的影響 見表2-3。與NG組比較，HG組HK-2細胞培養(yǎng)24、48或72 h后細胞上清液中TGF-β1和Fn表達均增加，且隨著時間的延長而增加（P＜0.01），HM組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，F(xiàn)A（20）組同步干預24、48或72 h后TGF-β1和Fn表達均減少（均P＜0.01）。

圖2顯示，與NG組比較，HG組HK-2細胞培養(yǎng)72 h后CTGF表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HM組差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，3個不同濃度的法舒地爾同步干預72 h后CTGF表達均減少（均P＜0.01），且與法舒地爾呈濃度依賴性。

表2 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞TGF-β1表達的影響（n=6，±s，μg·g-1）

表2 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞TGF-β1表達的影響（n=6，±s，μg·g-1）

與NG組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與HG組比：cP＜0.01

組別TGF-β124 h 48 h 72 h NG組47.18±4.43102.46±2.56116.02±5.21 HM組45.23±4.19 96.69±4.22114.12±4.93 HG組75.99±4.73b124.37±5.72b350.95±3.20bFA（20）組59.40±6.47ac95.33±3.94c207.18±8.04bc

表3 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞Fn表達的影響（n=6，±s，μg·g-1）

表3 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞Fn表達的影響（n=6，±s，μg·g-1）

與NG組比：aP＜0.01；與HG組比：bP＜0.01

組別Fn 24 h 48 h 72 h NG組206.62±11.70374.59±20.85449.01±22.95 HM組218.65±1.60376.72±8.31437.11±11.93 HG組266.79±15.33a487.23±42.67a680.99±13.68aFA（20）組214.70±26.54b213.40±1.65ab419.00±14.85b

3 討論

DN的發(fā)病機制十分復雜，目前尚未完全清楚。在DN中最早出現(xiàn)的變化是腎臟體積的增大，腎小管上皮細胞的肥大和增殖對整個腎臟體積的增大起著至關重要的作用。在本實驗中，我們用60 mmol/L的高糖作用于HK-2細胞，發(fā)現(xiàn)24 h后高糖明顯促進了HK-2細胞的增殖，從而引起DN的發(fā)生、發(fā)展。本研究結果與Wolf等[1]一致。

圖2 法舒地爾對高糖培養(yǎng)的HK-2細胞CTGF表達的影響

TGF-β1是公認致纖維化的細胞因子，在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2]。CTGF是近年來發(fā)現(xiàn)與纖維化密切相關的細胞因子，它作為TGF-β1的主要下游因子，通過促進細胞外基質合成，抑制細胞外基質降解從而引起纖維化的發(fā)生[3]。Fn是細胞外基質的主要成分之一，它的過度聚積使基質排列紊亂，從而使間質發(fā)生纖維化。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)HK-2細胞在60 mmol/L高糖條件下培養(yǎng)一段時間，TGF-β1、CTGF和Fn的表達均明顯增多，表明纖維化在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。且隨著高糖作用時間的延長，TGF-β1和Fn的表達顯著增多，這將導致纖維化逐漸加重，最終進展為終未期腎病。因此，抑制纖維化將成為治療DN的重要策略。

近年來，RhoA/ROCK信號通路在DN中的作用引起了人們的高度重視。目前有關RhoA/ROCK信號通路在DN中的研究大多集中在腎小球和系膜細胞[4-7]，如Danesh等[4]研究發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)24 h后大鼠腎小球系膜細胞Rho-GTP和Ras-GTP的表達明顯增加，但是越來越多的證據表明腎小管間質病變的嚴重程度與腎功能的進行性下降有著更為緊密的聯(lián)系[8-10]。法舒地爾是ROCK選擇性抑制劑，是目前唯一用于臨床的ROCK抑制劑，通過與ATP競爭ROCK催化區(qū)的ATP結合位點，而抑制ROCK的活性[11]。它對DN的保護作用已經在多種糖尿病動物模型中得到證實[12-15]。

在本實驗中，我們研究了ROCK信號通路在高糖培養(yǎng)的HK-2細胞中的作用，結果發(fā)現(xiàn)HK-2細胞在60 mmol/L的高糖中培養(yǎng)12 h后p-MYPT1的蛋白表達明顯升高，說明ROCK存在功能的活化，表明高糖能使HK-2細胞ROCK信號通路激活。本實驗還發(fā)現(xiàn)法舒地爾能明顯抑制ROCK的表達。同時我們發(fā)現(xiàn)，高糖組給予不同濃度法舒地爾處理后，能顯著抑制HK-2細胞的異常增殖，降低TGF-β1、CTGF和Fn的表達，提示法舒地爾通過抑制ROCK信號通路抑制細胞增殖，并下調高糖導致的致纖維化因子的表達，從而減輕腎小管上皮細胞纖維化程度。

綜上所述，高糖環(huán)境能明顯刺激腎小管上皮細胞增殖和纖維化，并激活細胞內ROCK信號通路；ROCK抑制劑法舒地爾能有效抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞過度增殖，抑制纖維化反應，提示法舒地爾對防治腎小管間質纖維化和延緩DN的進程可能起到較好的作用。我們的研究為法舒地爾的腎臟保護作用提供了更多的理論依據，但其中的有關機制還需要大量體內體外實驗來闡明。

[1] Wolf G. Molecular mechanisms of diabetic mesangial cell hypertrophy: a proliferation of novel factors[J]. J Am Soc Nephrol, 2002, 13(10): 2611-2613.

[2] Chou CH, Chuang LY, Lu CY, et al. Interaction between TGF-β and ACE2-Ang-(1-7)-Mas pathway in high glucosecultured NRK-52E cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 2013, 366 (1): 21-30.

[3] Okada H, Kikuta T, Kobayashi T, et al. Connective tissue growth factor expressed in tubular epithelium plays a pivotal role in renal fbrogenesis[J]. J Am Soc Nephrol, 2005, 16(1): 133-143.

[4] Danesh FR, Sadeghi MM, Amro N, et al. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase inhibitors prevent high glucose-induced proliferation of mesangial cells via modulation of Rho GTPase/p21 signaling pathway: implications for diabetic nephropathy[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(12): 8301-8305.

[5] Peng F, Wu D, Gao B, et al. RhoA/Rho-kinase contribute to the pathogenesis of diabetic renal disease[J]. Diabetes, 2008, 57(6): 1683-1692.

[6] 馬東蔚, 王秋月, 馬小羽, 等. 法舒地爾通過Rho/ROCK信號通路對高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細胞炎癥反應及纖維化的影響[J]. 中華內科雜志, 2011, 50(7): 580-584.

[7] Kolavennu V, Zeng L, Peng H, et al. Targeting of RhoA/ ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control[J]. Diabetes, 2008, 57(3): 714-723.

[8] Nangaku M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: fnal common pathways to end-stage renal failure[J]. Intern Med, 2004, 43(1): 9-17.

[9] Gu L, Gao Q, Ni L, et al. Fasudil inhibits epithelial-Myofibroblast transdifferentiation of human renal tubular epithelial HK-2 cells induced by high glucose[J]. Chem Pharm Bull, 2013, 61(7): 688-694.

[10] 吳甘霖, 賈汝漢, 肖圣順, 等. 貝尼地平對糖尿病大鼠腎臟保護作用的機制探討[J]. 中華糖尿病雜志, 2010, 2(4): 281-285.

[11] Wettschureck N, Offermanns S. Rho/Rho-kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology[J]. J Mol Med, 2002, 80(10): 629-638.

[12] Gojo A, Utsunomiya K, Taniguchi K, et al. The Rho-kinase inhibitor, fasudil, attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Eur J Pharmacol, 2007, 568 (1-3): 242-247.

[13] Xie X, Peng J, Chang X, et al. Activation of RhoA/ROCK regulates NF-κB signaling pathway in experimental diabetic nephropathy[J]. Mol Cell Endocrinol, 2013, 369(1-2): 86-97.

[14] Komers R, Oyama TT, Beard DR, et al. Rho kinase inhibition protects kidneys from diabetic nephropathy without reducing blood pressure[J]. Kidney Int, 2011, 79(4): 432-442.

[15] Wu G, Tu Y, Jia R. The infuence of fasudil on the epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells from diabetic rats[J]. Biomed Pharmacother, 2010, 64 (2): 124-129.

（本文編輯：胡苗苗）

Infuence of fasudil on the proliferation and fbrosis of renal tubular epithelial cells incubated with high glucose

GU Lingjia1, NI Liansong2.
1.Department of Endocrinology, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou, 318020; 2.Department of Endocrinology, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the influence of fasudil on the proliferation and fibrosis of human renal tubular epithelial cells incubated with high glucose.Methods:HK-2 cells were divided into normal control group (D-glucose 5.5 mmol/L), high tension group (D-glucose 5.5 mmol/L+54.5 mmol/L mannitol), high glucose group (D-glucose 60 mmol/L), high glucose+fasudil treatment group (the concentrations of fasudil were 5, 10 and 20 μmol/L). Cell proliferation was assessed with MTT assay. Changes in the p-MYPT1-Thr853 were detected with co-immunoprecipitation assay. The expression of connective tissue growth factor (CTGF) was detected with western blot, the protein content of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and fbronectin (Fn) in the supernatant were detected by ELISA.Results:Compared with normal control group, cell proliferation and the expression of p-MYPT1-Thr853, TGF-β1, CTGF and Fn were signifcantly increased in high glucose group. Compared with high glucose group, cell proliferation and the expression of p-MYPT1-Thr853, TGF-β1, CTGF and Fn were signifcantly decreased in fasudil treatment group.Conclusion:Fasudil can inhibit high glucose-induced proliferation and fbrosis of HK-2 and it may produce effect through the inhibition of Rho kinase activity.

fasudil; renal tubular epithelial cells; fbrosis; diabetic nephropathy

R965.2

A

1000-2138（2014）10-0723-05

2013-08-27

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20100020）。

顧玲佳(1986-)，女，浙江臺州人，住院醫(yī)師，碩士。

倪連松，主任醫(yī)師，碩士生導師，Email：nils1014@ 163.com。