牛志剛，陳 童，於建國(guó)，郝 耿，季耀光，史洪才

（1.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧科學(xué)研究所）

阿勒泰羊Myf5基因多態(tài)性與早期生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性分析

牛志剛1，陳 童2，於建國(guó)2，郝 耿2，季耀光2，史洪才1

（1.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧科學(xué)研究所）

采用PCR測(cè)序方法研究了152只阿勒泰羊群體Myf5基因多態(tài)性及其與群體生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明:在阿勒泰羊Myf5基因中存在3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，即位于Myf5基因第1外顯子區(qū)域的19-CCT Ins/Del、第4外顯子區(qū)域的C-109G以及C-383T；在這些位點(diǎn)均存在3種基因型。多態(tài)位點(diǎn)與體重和日增重的相關(guān)性分析表明，僅SNP位點(diǎn)C-383T與體重和平均日增重具有相關(guān)性（P<0.05），不同基因型體重和日增重排序?yàn)門T

阿勒泰羊；Myf5基因；多態(tài)性；生長(zhǎng)性狀

肌肉調(diào)控因子（muscle regulatory factors，MRFs）家族是參與肌肉生成過程分子調(diào)控機(jī)制的一個(gè)重要基因家族。在肌肉早期分化和后期生長(zhǎng)發(fā)育過程中，MRFs家族成員以特定的時(shí)間和空間順序有機(jī)地組合在一起，按照特定數(shù)量表達(dá)，在功能上相互協(xié)同，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)出該家族的高度保守性和協(xié)調(diào)性。MRFs基因家族調(diào)控整個(gè)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過程。從肌祖細(xì)胞的定型、增殖和肌纖維的形成，直到個(gè)體出生后的肌肉成熟和功能的完善，都有肌肉調(diào)控因子家族的參與。因此，MRFs基因家族對(duì)動(dòng)物肌細(xì)胞的分化和骨骼肌系統(tǒng)的發(fā)育成熟具有重要的意義。

MRFs基因家族編碼4種不同的肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子，分別為MyoD（MyoDl，Myf3）、肌肉生成素基因MyoG（myogenin，Myf4）、Myf5及Myf6（MRF4，Herculin）。它們各自或協(xié)同控制著骨骼肌生成［1-2］。Myf5是第一個(gè)表達(dá)的MRFs家族成員，在胚胎發(fā)育第8天即開始表達(dá)（Julien Giordmi，2007）。Myf5基因主要在動(dòng)物出生后激活，維持肌纖維的分化狀態(tài)，通過其對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞與肌纖維的融合作用在肌肉肥大生長(zhǎng)中起作用［3-4］。關(guān)于綿羊Myf5基因

遺傳多態(tài)性研究相對(duì)較少。本研究在國(guó)內(nèi)首次對(duì)阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)進(jìn)行了全測(cè)序，首次發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的多態(tài)性位點(diǎn)。通過分析該基因的多態(tài)性與阿勒泰羊早期生長(zhǎng)發(fā)育性狀相關(guān)性，以期得到與阿勒泰羊生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，初步揭示Myf5基因與阿勒泰羊生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)性，為新疆阿勒泰羊的分子遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

在阿勒泰福海種羊場(chǎng)選取152只阿勒泰羊，測(cè)定其出生體重，1、3、6月齡體重和體尺指標(biāo)（體高、體長(zhǎng)、胸圍、肩寬、臀寬、胸深等），分析阿勒泰羊早期生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，繪制該群體的生長(zhǎng)曲線。

1.2 試驗(yàn)羊數(shù)據(jù)的采集

測(cè)定羊只出生體重，1、3、6月齡體重和體尺指標(biāo)（體高、體長(zhǎng)、胸圍、肩寬、臀寬、胸深等）。各指標(biāo)測(cè)定方法按張沅［5］文獻(xiàn)介紹的方法進(jìn)行。

1.3 Myf5基因PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

參考人和牛的Myf5基因序列，利用電子克隆技術(shù)獲得綿羊Myf5基因序列，設(shè)計(jì)該基因4個(gè)外顯子區(qū)域的引物（見表1）。PCR反應(yīng)條件：94℃4 min；94℃60 s，58～62℃60 s，72℃60 s，33個(gè)循環(huán)；72℃7 min；4℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，該工作由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 測(cè)序引物及序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用最小二乘方差，分析新疆阿勒泰羊Myf5基因不同位點(diǎn)基因型與體重和平均日增重的相關(guān)性，比較不同基因型阿勒泰羊的早期生長(zhǎng)發(fā)育差別。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)序列的測(cè)定

本研究依據(jù)電子克隆獲得Myf5基因序列，選擇152只阿勒泰羊進(jìn)行序列測(cè)定。利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)，Myf5基因編碼區(qū)的測(cè)序結(jié)果與電子克隆結(jié)果完全一致，阿勒泰羊中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，包括2個(gè)SNP位點(diǎn)和1個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，分別為Myf5基因的第1外顯子區(qū)域第19～20位之間有一個(gè)插入CCT（19CCT ins/del）、第 4外顯子區(qū)域的第 109位 C→G（C-109G）、第383位C→T（C-383T），并且在這些突變位點(diǎn)均存在3種基因型。第19～20處多態(tài)位點(diǎn) 19CCT ins/del的測(cè)序結(jié)果見圖1，SNP C-109G的測(cè)序結(jié)果如圖2，SNP C-383T的測(cè)序結(jié)果如圖3。從圖1可見，CCT插入/缺失雜合子反向測(cè)序峰圖在tcc之后出現(xiàn)雜亂套疊峰；從圖2、3可見，2個(gè)SNP位點(diǎn)處均存在3種等位基因型。

圖1 Myf 5-1第19-20位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

圖2 Myf 5-4第109位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

圖3 Myf 5-4第383位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

2.2 阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)序列3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性分析

2.2.1 基因型頻率和基因頻率 試驗(yàn)中采集了152只阿

勒泰羊，經(jīng)基因編碼區(qū)序列測(cè)定，共發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。通過從群體遺傳學(xué)角度分析統(tǒng)計(jì)阿勒泰群體在Myf5基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率（見表2）。

從表2可見，Myf5基因第1外顯子區(qū)域的19-CCT Ins/Del的多態(tài)性中，CCT缺失為優(yōu)勢(shì)等位基因，CCT-/-為優(yōu)勢(shì)等位基因型；第4外顯子區(qū)域的C-109G在阿勒泰羊群體中，等位基因C的頻率占優(yōu)勢(shì)，CC基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；第4外顯子區(qū)域的C-383T多態(tài)性中，等位基因C的頻率占優(yōu)勢(shì)，CC基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，阿勒泰羊群體在Myf5基因上的這3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 基因型頻率和基因頻率

2.2.2 阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)序列3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)多態(tài)信息含量和純合度分析 阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)序列3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)以及多態(tài)信息含量見表3，結(jié)果顯示阿勒泰羊群體中這3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)。

表3 阿勒泰羊群體多態(tài)位點(diǎn)多態(tài)信息量、純合度、雜合度和等位基因數(shù)分析

2.3 阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)序列3個(gè)SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的相關(guān)性分析

從表4可見，阿勒泰羊群體C-383T位點(diǎn)不同基因型個(gè)體的初生重、3月齡重存在顯著差異（P<0.05）。對(duì)于初生重、3月齡重及6月齡重，群體TT、CT、CC三種基因型的體重平均值表現(xiàn)為：TT

表4 Myf5-4-383多態(tài)位點(diǎn)不同基因型對(duì)體重的影響

如表5可見，3～6月齡日增重基因型CC和CT及TT之間差異顯著（P<0.05），對(duì)于0～3月齡和3～6月齡日增重群體TT、CT、CC三種基因型的體重平均值表現(xiàn)為：TT

表5 Myf5-4-383多態(tài)位點(diǎn)不同基因型對(duì)平均日增重的影響

3 討論

Myf5基因是MyoD家族中第一個(gè)表達(dá)的，與肌纖維數(shù)量和大小關(guān)系密切的調(diào)節(jié)因子。韋宏偉等［6］采用PCR-SSCP方法檢測(cè)天府肉羊、成都麻羊Myf5基因的多態(tài)性，在Myf5基因第1外顯子檢測(cè)到有一個(gè)突變位點(diǎn)，包含AA、AB和BB三種基因型。通過與生長(zhǎng)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析表明：在天府肉羊中，基因型AA和AB的體重與BB型間差異極顯著（P<0.01），基因型AA的管圍與BB間差異顯著（P<0.05）；而在成都麻羊中，基因型AA和AB的體重、管圍與BB型間差異顯著（P<0.05）。張海軍等［7］采用PCR-SSCP方法對(duì)波爾山羊和徐淮山羊Myf5基因座進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在徐淮山羊中存在3種基因型AA、AB和BB，而在波爾山羊中僅存在AA一種基因型。通過與體尺進(jìn)行相關(guān)性分析表明，Myf5基因座對(duì)管圍和管圍指數(shù)的效應(yīng)差異顯著（P<0.05）。凌飛等［8］采用PCR-RFLP技術(shù)研究豬的Myf5基因的多態(tài)性，結(jié)果表明，長(zhǎng)藍(lán)豬Myf5基因擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)肺重（P=0.046 1）有顯著影響，對(duì)胴體瘦肉量（P=0. 065 1）、胃重（P=0.086 8）有一定影響。其中Myf5基因擴(kuò)增產(chǎn)物的HpaII酶和HaeⅢ酶的酶切位點(diǎn)多態(tài)性與胴體瘦肉量有一定的影響（P=0.065 1），Myf5基因型方差占表型方差的比例為4.618 1%，說明該基因的遺傳變異確實(shí)與肌肉的生成有一定的關(guān)系。薛愷等［9］分析南陽(yáng)牛和秦川牛Myf5基因進(jìn)行多態(tài)性分析，多態(tài)位點(diǎn)有AA、AB和BB三種基因型，將這3種基因型與其體重、體尺等生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，南陽(yáng)牛群體內(nèi)AB與BB基因型個(gè)體在斷奶前平均日增重和6月齡體重指標(biāo)上有顯著差異，且BB>AB（P<0.05）；而群體內(nèi)各基因型個(gè)體在初生、12月齡、18月齡以及2歲的體重和體尺指標(biāo)（體高、體斜長(zhǎng)、胸圍）上均無顯著性差異（P>0.05），推測(cè)Myf5基因的遺傳變異可能與牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀的差異相關(guān)，尤其是與體重變化相關(guān),并初步認(rèn)為BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。陳雪梅等［10］克隆出了不同牛種的Myf5基因部分片段，發(fā)現(xiàn)三江黃牛、德昌水牛和大額牛有1個(gè)突變位點(diǎn)，與普通牛同源性為99.2%。而九龍牦牛有2個(gè)突變位點(diǎn)，與普通牛同源性為98.5%。

本研究在國(guó)內(nèi)首次對(duì)阿勒泰羊Myf5基因編碼區(qū)進(jìn)行了全測(cè)序，首次發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的SNP位點(diǎn)。Myf5基因在新疆阿勒泰羊群體中的遺傳變異度，即雜合度為中等多態(tài)性。Myf5基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)基因座處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明這個(gè)位點(diǎn)的基因頻率沒有受到人工選育、遷徙和遺傳漂變等因素的影響，這也與新疆阿勒泰羊的生產(chǎn)現(xiàn)狀一致。本研究發(fā)現(xiàn)的Myf5基因第4外顯子區(qū)383位SNP位點(diǎn)與體重和平均日增重具有相關(guān)性（P<0.05）。初步確定在新疆阿勒泰羊早期生長(zhǎng)發(fā)育中尤其是3～5月齡時(shí)，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，可以作為性狀分子遺傳篩選標(biāo)記，為阿勒泰羊的分子育種奠定基礎(chǔ)。

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Polymorphism of Myf5 Gene and Its Association with Body Weight Traits in Aletai Sheep

Niu Zhi-gang1，Chen Tong2，Shi Hong-cai1，et al
（1.KeyLaboratoryofMinistryfor Biotechnology，XinjiangAcademyofAnimal Science，Urumqi 830000，China；2.XinjiangAcademyofAnimal Science）

A population 152 Aletai sheep were used to study the polymorphism ofMyf5 gene and its association with body weight traits by PCR sequencing technique.The results showed that there were three mutations inMyf5 gene，locating in the 19-CCT Ins/Del of exon 1，C-109G and C-383T ofexon 4 respectively;every locus had three genetypes.The association between the polymorphisms and body weight traits showed that only the polymorphism of C-383T and the body weight，the averagely daily gain had significant associations（P<0.05），the average bodyweight ofthe three genotypes were TT

Aletai sheep；Myf5 gene；polymorphism；growth traits

S826.2

A

2095-3887（2014）05-0009-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.002

2014-08-29

新疆自治區(qū)國(guó)際科技合作項(xiàng)目（201141143）；新疆自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（201230116-9）

牛志剛（1979-），男，助理研究員。

史洪才（1969-），男，研究員。研究方向：家畜遺傳育種。