呂春榮，權(quán)國(guó)波，歐陽(yáng)依娜，沈 偉，洪瓊花

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)）

繁殖與生理

云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)體系的建立

呂春榮1，權(quán)國(guó)波1，歐陽(yáng)依娜1，沈 偉2，洪瓊花1

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)）

試驗(yàn)旨在研究云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，為下一步的誘導(dǎo)分化研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用組織塊法原代培養(yǎng)云南半細(xì)毛羊HFSCs。并對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定。培養(yǎng)結(jié)果：HFSCs為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，體積小，核質(zhì)比高，呈典型的鋪路石狀，在顯微鏡下折光性強(qiáng)、胞體透亮。免疫組化分析結(jié)果表明：細(xì)胞表達(dá)K14、不表達(dá)CD271。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為HFSCs。結(jié)論：試驗(yàn)采用組織塊培養(yǎng)法初步建立了云南半細(xì)毛羊無(wú)血清培養(yǎng)HFSCs，這對(duì)于探討云南半細(xì)毛羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制以及成體干細(xì)胞增殖分化特性具有非常重要的意義。

云南半細(xì)毛羊；毛囊干細(xì)胞；分離培養(yǎng)

近年來(lái)，隨著上皮生物學(xué)和組織工程皮膚研究的不斷深入，毛囊干細(xì)胞（HFSCs）研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。HFSCs來(lái)源豐富，取材方便，又避免了倫理和道德方面的限制。然而，目前HFSCs研究主要集中于人和小鼠，研究重點(diǎn)主要偏向于臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，位于毛囊隆突部的HFSCs不僅對(duì)毛發(fā)周期的維持具有重要意義，而且與皮膚損傷修復(fù)、組織維持和更新、皮膚腫瘤的發(fā)生等都密切相關(guān)［1］。

開展云南半細(xì)毛羊HFSCs研究對(duì)于半細(xì)毛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。體外培養(yǎng)半細(xì)毛羊HFSCs，對(duì)于探討半細(xì)毛羊毛囊生長(zhǎng)規(guī)律、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制等研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，并最終實(shí)現(xiàn)改善羊毛品質(zhì)，提高羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量。有關(guān)綿羊HFSCs的報(bào)道，僅有郭婷婷等［2］開展了細(xì)毛羊HFSCs分離培養(yǎng)方法比較研究。一些學(xué)者開展了山羊HFSCs的研究。史明艷等［3］研究結(jié)果表明：組織塊法和酶消化法均能分離得到山羊HFSCs并進(jìn)行傳代，但隨著傳代次數(shù)的增加，組織塊法獲得的細(xì)胞免疫組化染色陽(yáng)性率、克隆形成率以及傳代能力均顯著

高于酶消化法獲得的細(xì)胞。此外，也有學(xué)者開展了羊駝HFSCs的研究。弓慧敏等［4］分離得到羊駝單個(gè)毛囊，再利用0.2%的中性蛋白酶消化獲得HFSCs并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

本試驗(yàn)首次建立了無(wú)血清HFSCs培養(yǎng)體系，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記物鑒定，初步證明培養(yǎng)的細(xì)胞為HFSCs。該項(xiàng)研究對(duì)于探索半細(xì)毛羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律具有非常重要的意義。同時(shí)為下一步HFSCs誘導(dǎo)分化研究奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

云南半細(xì)毛羊由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供，試驗(yàn)用組織塊取自成年羊背部皮膚。

1.2 主要試劑

胰蛋白酶和青鏈霉素溶液（PS）購(gòu)自Bioind公司；DMEM/F12和 B27購(gòu)自 Gibco公司；b-FGF購(gòu)自 PEPROTECH公司；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和K14購(gòu)自Abcam公司；CD271購(gòu)自Pierce公司。其余試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HFSCs的分離培養(yǎng) 取云南半細(xì)毛羊背部皮膚樣本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理鹽水+1%PS洗3次，手術(shù)刀片刮去皮膚表面污物。手術(shù)剪和鑷子剔除多余脂肪及結(jié)締組織后，剪成0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm的皮膚塊。將皮膚塊在緩沖液（DMEM-F12+1%PS）中洗3次。體視鏡下用眼科鑷將毛囊從皮膚真皮層拔出。毛囊收集后在緩沖液中洗3次后，移入12孔板中，每孔4～6根，加入0.5 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液：DMEM-F12+bFGF 40 ng/mL+EGF 20 ng/mL+B27 20 μL/mL+1%PS。最后放入培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度）中培養(yǎng)。體視顯微鏡觀察、照相、記錄細(xì)胞遷移和增殖情況。

1.3.2 HFSCs的傳代培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，將培養(yǎng)液棄去，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）在37℃消化5～8 min后，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞開始變圓時(shí)加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞使其完全脫落，以1:2的比例進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并拍照。

1.3.3 HFSCs的免疫組化鑒定 制備細(xì)胞爬片，參照各抗體說(shuō)明進(jìn)行K14、CD271免疫熒光檢測(cè)。步驟如下：細(xì)胞爬片用PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min；4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；0.3%TritonX-100處理10 min，PBS緩沖液洗3次，每次5 min；用含10%山羊血清的PBS在37℃，封閉30 min；PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；滴加適當(dāng)稀釋的一抗，對(duì)照組用PBS代替一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃過(guò)夜。PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；滴加稀釋后的熒光素標(biāo)記二抗IgG，置于濕盒內(nèi)，37℃保溫1 h。PBS緩沖液PBS洗3次，每次5 min。放置激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HFSCs原代培養(yǎng)

從毛囊遷移出來(lái)的上皮樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)（平均約5 d），細(xì)胞呈鑲嵌多角形，折光性強(qiáng)，表現(xiàn)為鋪路石樣；核大而明顯，多偏居于細(xì)胞一側(cè)（如圖1A所示）。2～3 d后，細(xì)胞開始匯合，最終形成密集的片狀克隆（如圖1B所示）。

圖1 組織塊法培養(yǎng)HFSCs形態(tài)

2.2 HFSCs傳代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)的云南半細(xì)毛羊HFSCs放大后清晰可見(jiàn)，細(xì)胞間界限明顯，呈鋪路石樣，核質(zhì)比大，多個(gè)核仁（如圖2A、2B所示）。形態(tài)上完全符合HFSCs的基本特征。

圖2 第3代HFSCs形態(tài)

2.3 HFSCs的免疫組化鑒定

由于HFSCs尚無(wú)高度特異性的表面標(biāo)志，因此本試驗(yàn)采取K14、CD271對(duì)其進(jìn)行共同鑒定。免疫組化結(jié)果表明，HFSCs表達(dá)K14（如圖3B所示），而不表達(dá)CD271（如圖3A所示）。通過(guò)對(duì)原代和第5代細(xì)胞進(jìn)行鑒定后，筆者認(rèn)為所培養(yǎng)的細(xì)胞為HFSCs。

圖3 組織塊法培養(yǎng)HFSCs形態(tài)

3 討論

目前，HFSCs研究多集中于人和小鼠。實(shí)驗(yàn)室研究多以鼠觸須為模型，從中分離隆突部干細(xì)胞。由于鼠觸須不僅毛囊體積大，而且隆突部位明顯，易于顯微操作。在顯微鏡下分離、切取毛囊后，用酶直接消化隆突部，獲得單個(gè)細(xì)胞。還有報(bào)道從人頭枕部毛發(fā)分離干細(xì)胞，主要采取拔毛法，從枕部皮膚中拔出完整毛囊，然后用胰酶消化獲得干細(xì)胞。根據(jù)目前報(bào)道，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到綿羊HFSCs體外無(wú)血清培養(yǎng)體系。本試驗(yàn)組用DMEM-F12+bFGF 40 ng/mL+EGF 20 ng/mL+B27 20 μL/mL+1%PS無(wú)血清培養(yǎng)液，首次建立了綿羊HFSCs體外無(wú)血清培養(yǎng)體系，并對(duì)獲得的HFSCs進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)志物鑒定，初步證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為HFSCs。

3.1 HFSCs體外無(wú)血清培養(yǎng)

體外培養(yǎng)HFSCs所用培養(yǎng)液根據(jù)是否添加有血清，分為有血清培養(yǎng)體系和無(wú)血清培養(yǎng)體系。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法必須在培養(yǎng)液中加入一定比例的血清以利其生長(zhǎng)，但各血清間所含的生長(zhǎng)因子和激素以及其他一些因素隨批次的變化非常大，這就影響了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。楊婷等［5］比較無(wú)血清及含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）生物學(xué)特性，尋求無(wú)血清的UC-MSC培養(yǎng)方法。結(jié)果表明：無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSC細(xì)胞較小、傳代增殖潛能較強(qiáng)、無(wú)異種蛋白，而且抑制T細(xì)胞增殖作用更明顯。體外培養(yǎng)和擴(kuò)增大鼠

毛囊Bulge細(xì)胞，無(wú)血清的K-SFM培養(yǎng)基較有血清DMEM-Fl2培養(yǎng)基更有利于Bulge細(xì)胞的擴(kuò)增和表型的維持［6］。

很多試驗(yàn)研究證實(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)基更有利于毛囊的生長(zhǎng)。張兆遠(yuǎn)［7］通過(guò)對(duì)濟(jì)寧青山羊皮膚毛囊體外培養(yǎng)研究得出：對(duì)于山羊游離毛囊的體外培養(yǎng)，無(wú)血清的Williams E培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均是適宜的，但在Williams E培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度更快，說(shuō)明Williams E培養(yǎng)基更適合山羊游離毛囊的培養(yǎng)。崔志峰等［8］建立了適宜山羊毛囊體外培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，通過(guò)添加谷氨酰胺、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉等成分，在31℃、95%空氣和5%CO2條件下，可將山羊毛囊培養(yǎng)到30d以上，并確定添加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)細(xì)毛羊和山羊HFSCs進(jìn)行了研究，并初步建立了HFSCs的分離和培養(yǎng)技術(shù)體系，但他們采用的培養(yǎng)體系并不是無(wú)血清培養(yǎng)體系［2-3］。在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，如何長(zhǎng)期保持干細(xì)胞的生物學(xué)特性至今仍是個(gè)難題。成分復(fù)雜的培養(yǎng)基中血清是個(gè)難以去除的干擾因素。本試驗(yàn)首次使用無(wú)血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)云南半細(xì)毛羊HFSCs，并使其在體外培養(yǎng)條件下能較好地保持其生物學(xué)特性。從而為體外穩(wěn)定培養(yǎng)HFSCs及進(jìn)一步研究其分化提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 HFSCs的鑒定

不同種類的干細(xì)胞都具有各自的形態(tài)特征。這也是鑒定干細(xì)胞的傳統(tǒng)方法之一。從細(xì)胞的形態(tài)上來(lái)說(shuō)，本試驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈立方形，細(xì)胞體積小，細(xì)胞大小一致，核大而明顯且多偏居于細(xì)胞一側(cè)，核漿比大，表面多隆起，皺折少，可初步判定為HFSCs。

體內(nèi)HFSCs用標(biāo)記滯留法鑒定，而體外分離培養(yǎng)的HFSCs則用特異性標(biāo)記來(lái)鑒定。Ma等［9］報(bào)道潛在的HFSCs特異性標(biāo)記主要包括：β1-integrin、K15、K19、轉(zhuǎn)鐵蛋白、受體CD71、CD34及轉(zhuǎn)錄因子P63等。Kaur等［10］的試驗(yàn)結(jié)果表明，HFSCs表達(dá)高水平的β1-integrin。目前比較公認(rèn)HFSCs標(biāo)志主要有K19［10］、β1-integrin［11］、CD34［12］，和K15等［13］。

本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離的HFSCs高表達(dá)K14，表達(dá)率92%，而不表達(dá)CD271。本試驗(yàn)結(jié)果與史明艷等［14］、Inoue等［15］的報(bào)道相符。

4 結(jié)論

本研究對(duì)綿羊HFSCs的培養(yǎng)進(jìn)行了嘗試，首次建立了云南半細(xì)毛羊HFSCs無(wú)血清培養(yǎng)體系，并進(jìn)行了初步驗(yàn)證。然而，鑒于目前國(guó)內(nèi)外綿羊HFSCs的研究報(bào)道相對(duì)較少，因此應(yīng)采用更有利的技術(shù)手段，如流式鑒定、誘導(dǎo)分化，來(lái)證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是HFSCs。該項(xiàng)研究對(duì)于探討半細(xì)毛生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律以及成體干細(xì)胞增殖分化特性研究具有非常重要的意義。

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Establishment of Serum Free Culture of Hair Follicle Stem Cell in Yunnan Semi-fine Wool Sheep

LvChun-rong，Quan Guo-bo，HongQiong-hua，et al
（Yunnan AcademyofAnimal and VeterinarySciences，Kunming650224，China）

This experiment was aimed to study the separation，culture and identification methods of hair follicle stem cells（HFSCs）：for the development offurther research on cell differentiation.Method：The tissue piece culture method was used to separate and culture HFSCs.Then the cultured cells were identified by immunohistochemistry.Result：The established HFSCs exhibited adherent growth type，small volume，high nucleus/cytoplasmratio，high refractivityand transparent cell appearance.Immunofluorescence assay indicated that Yunnan semi-fine wool sheep HFSCs expressed K14，not expressed CD271.These results further proved that the cultured cells were indeed HFSCs.Conclusion：A serum free culture system of Yunnan semi-fine wool sheep HFSCs was established using the tissue piece culture method.This study is very important for investigation of the regulation mechanismofdevelopment ofwool follicle and the characterstics of proliferation and differentiation ofHFSCs.

Yunnan semi-fine wool sheep；HFSCs；separation and culture

S826

A

2095-3887（2014）05-0022-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.006

2014-06-04

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-40）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目（2012FD083）

呂春榮（1982-），女，助理研究員，碩士。

洪瓊花（1968-），女，白族，研究員，碩士，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。