彭紅春　謝明　沈奕　彭丹

[摘要] 目的 探討關(guān)節(jié)軟骨中組織金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）基因啟動子區(qū)甲基化與其蛋白表達(dá)的相關(guān)性，并分析TIMP-3基因CpG島異常甲基化與骨關(guān)節(jié)炎（OA）的關(guān)聯(lián)性。 方法 應(yīng)用甲基化特異性的聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）技術(shù)和免疫組織化學(xué)SP法分別檢測14例健康人的正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和35例骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者軟骨細(xì)胞TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化和蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 OA患者和健康人關(guān)節(jié)軟骨中TIMP-3基因啟動子區(qū)均有甲基化修飾，其陽性率分別為74.3%（26/35）和35.7%（5/14），OA組TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化率明顯高于健康組（P<0.05）。14例健康人中，軟骨細(xì)胞TIMP-3蛋白表達(dá)陽性10例（71.4%），而35例OA患者中，軟骨細(xì)胞TIMP-3蛋白表達(dá)陽性11例（31.4%）。24例OA患者軟骨細(xì)胞蛋白表達(dá)陰性的標(biāo)本中，TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性21例（87.5%）；26例TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性的標(biāo)本中，蛋白表達(dá)陰性21例（80.8%），TIMP-3啟動子區(qū)甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 啟動子區(qū)CpG島高甲基化是OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3表達(dá)失活的主要機(jī)制之一，其可能參與了OA的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 骨關(guān)節(jié)炎；甲基化；TIMP-3啟動子；CpG島

[中圖分類號] R684.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）01（b）-0004-04

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。有研究認(rèn)為OA軟骨的破壞可能與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解酶（如膠原酶和蛋白聚糖酶），從而導(dǎo)致ECM降解增加和（或）ECM合成減少有關(guān)；而金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是這些酶的天然抑制劑[2]。TIMP-3為TIMPs家族中的一個特殊成員，在OA患者和正常人軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)。TIMP-3能抑制膠原酶和蛋白聚糖酶對ECM的降解，并促進(jìn)ECM合成[3]。TIMP-3還能下調(diào)IL-1、TNF-α、IL-6表達(dá)，減少其對骨關(guān)節(jié)軟骨的破壞[4]。研究發(fā)現(xiàn)TIMP-3基因敲除小鼠患骨關(guān)節(jié)炎的易感性增加，而啟動子區(qū)甲基化可能是 TIMP-3基因失活的機(jī)制[5]。筆者采用亞硫酸氫鈉測序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中 TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化情況，采用免疫組織化學(xué)SP方法檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中TIMP-3蛋白的表達(dá)情況，以探討TIMP-3基因在OA發(fā)生發(fā)展中的作用以及其失活機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

14例正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2011年9月～2012年10月年因交通事故在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院行大腿中下段截肢的患者，男性8例，女性6例，年齡19～60歲，平均40歲。30例OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2011年9月～2012年10月年在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院就診，根據(jù)1995年美國風(fēng)濕協(xié)會骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為OA且有膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)指征的患者，男16例，女19 例，平均年齡65歲。術(shù)中無菌采集標(biāo)本，每組標(biāo)本分為2份：1份石蠟包埋，進(jìn)行免疫組化檢測；另1份放液氮罐內(nèi)保存，以行分子生物學(xué)分析。

1.2 亞硫酸氫鈉測序

取約50 mg組織，經(jīng)EDTA脫鈣液脫鈣后，加入組織裂解液進(jìn)行勻漿，勻漿經(jīng)蛋白酶K消化，用心吸附柱法提取軟骨組織DNA，外分光光度計檢測DNA純度和濃度，4℃保存?zhèn)溆茫铆傊请娪痉ㄨb定DNA完整性。取30 μl DNA水溶液用EZ DNA Methylation-Gold KitTM DNA甲基化試劑盒（北京天漠公司）進(jìn)行純化和修飾。處理好的DNA放入-70℃冰箱保存。

采用Methyl Primer Express V1.0軟件（ABI公司）設(shè)計TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化引物序列，并由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TIMP-3甲基化上游引物序列為5′-CGTTTCGTTATTTTTT-GTTTTCGGTTTC-3′，下游引物序列為5′-CCGAAA-ACCCCGCCTCG-3′（116 bp），TIMP-3非甲基化上游引物序列為5′-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3′，下游引物序列為5′-CCCCCAAAAACCCCACCTCA-3′（122 bp）。PCR總反應(yīng)體系20 μl：模板DNA為2 μl，Taq 酶10 μl，上游及下游引物各0.8 μl，加ddH2O至總體積20 μl。取10 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min（電壓100 V），溴乙錠染色，紫外燈下檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，數(shù)碼相機(jī)攝片保存，PCR產(chǎn)物 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3免疫組織化學(xué)檢測

石蠟包埋組織標(biāo)本，5 μm連續(xù)切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶SP法檢測， 切片常規(guī)脫蠟處理后，置于抗原修復(fù)液中95℃ 10～15 min進(jìn)行修復(fù)，其余步驟參照說明書進(jìn)行。切片經(jīng)梯度乙醇脫水、干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料數(shù)據(jù)采用百分率表示，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher 確切概率法檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA完整性檢測

提取的基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段明顯大于1000 bp，DNA完整，無降解（圖1）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳中的DNA片段

2.2 兩組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)比較

以不加DNA標(biāo)本為空白對照組，其中OA患者與健康人軟骨中TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性率分別為74.3%（26/35）和35.7%（5/14），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.402，P=0.0114）（圖2，表1）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳法顯示的健康組及OA組關(guān)節(jié)軟骨中

TIMP-3啟動子區(qū)甲基化情況

M.TIMP-3甲基化引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物（116 bp）；U.TIMP-3非甲基化引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物（122 bp）；A.OA組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞； B.健康組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；C.空白對照

表1 OA組和健康組關(guān)節(jié)軟骨中TIMP-3啟動子區(qū)甲基化水平

2.3 兩組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3蛋白表達(dá)情況

TIMP-3蛋白表達(dá)陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)棕黃色染色，經(jīng)分析健康人和OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3蛋白陽性率分別是71.4%（10/14）和31.4%（11/35），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.533，P=0.0106）（圖3，表2）。

A B C

圖3 TIMP-3蛋白在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中的表達(dá)（SP×200）

A.陰性（胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)藍(lán)色染色）；B.陽性（胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)棕黃色染色）；C.健康組陽性（胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)棕黃色染色）

表2 健康組和OA組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中TIMP-3蛋白表達(dá)情況

2.4 OA患者軟骨細(xì)胞TIMP-3啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系

26例TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性的OA患者中，21例TIMP-3蛋白表達(dá)陰性（80.8%）；而24例TIMP-3蛋白表達(dá)陰性的OA患者中，21例TIMP-3啟動子甲基化陽性（87.5%）。Spearman等級相關(guān)分析表明TIMP-3啟動子甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.447，P=0.000）（表3）。

表3 OA患者軟骨細(xì)胞TIMP-3啟動子甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞和關(guān)節(jié)周圍骨贅形成，考慮可能與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解與合成代謝失衡有關(guān)[6]。已有研究證明基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的損傷是OA發(fā)病機(jī)制之一。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，TIMPs與MMPs之間的平衡對機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的遷移和ECM重建起關(guān)鍵作用，平衡一旦遭到破壞，將導(dǎo)致一系列病理過程的發(fā)生[7]。TIMP-3是TIMPs家族中唯一存在于ECM中的非溶性蛋白質(zhì)，與ECM緊密結(jié)合，避免ECM受金屬蛋白酶及蛋白聚糖酶的降解。

在骨關(guān)節(jié)炎中，IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)使骨關(guān)節(jié)軟骨中MMPs水平升高，從而使骨關(guān)節(jié)軟骨外周基質(zhì)破壞增加[4，8]。而當(dāng)TIMP-3水平升高時，能負(fù)反饋調(diào)節(jié)其對軟骨外周基質(zhì)的破壞作用。由于OA是隨年齡增長的退行性病變，從胚胎發(fā)育到成年，骨與關(guān)節(jié)組織中TIMP-3啟動子活性逐漸降低[9]。此外，Mahmoodi等[5]研究發(fā)現(xiàn)在TIMP-3基因敲除小鼠中，TIMP-3表達(dá)缺失可增加小鼠骨關(guān)節(jié)炎的易感性。同樣Zreiqat 等[10]研究表明，在OA中晚期，骨關(guān)節(jié)軟骨組織中TIMP-3水平明顯下降。本研究也發(fā)現(xiàn)與正?；颊呦啾龋琌A患者骨關(guān)節(jié)軟骨組織中TIMP-3蛋白表達(dá)較低。這與Zreiqat 等[10]的研究結(jié)果一致。因此，筆者推測TIMP-3蛋白表達(dá)下降或活性喪失可能是OA的發(fā)病機(jī)制之一。然而，在OA發(fā)病過程中，TIMP-3表達(dá)下降的原因尚不清楚。

DNA甲基化通常發(fā)生在CpG位點(diǎn)的C上，其能使某些基因的活性喪失[11]。多研究表明在腫瘤組織中存在TIMP-3啟動子區(qū)甲基化，其可導(dǎo)致TIMP-3基因表達(dá)下降和缺失。TIMP-3基因啟動子區(qū)甲基化水平隨年齡增加而升高[9，12]。因此，筆者推測OA患者骨與關(guān)節(jié)組織TIMP-3表達(dá)下降，可能與基因啟動子區(qū)甲基化水平升高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)OA患者和健康人軟骨細(xì)胞TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性率分別為74.3%（26/35）和35.7%（5/14），提示OA患者TIMP-3呈高甲基化狀態(tài)。除此之外，TIMP-3蛋白表達(dá)陰性的OA患者其TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性，而某些TIMP-3啟動子區(qū)甲基化陽性的標(biāo)本無蛋白表達(dá)，進(jìn)一步統(tǒng)計分析表明基因啟動子區(qū)甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，筆者認(rèn)為TIMP-3甲基化可能與OA發(fā)展過程中TIMP-3蛋白表達(dá)降低有關(guān)。

TIMP-3啟動子區(qū)異常甲基化時，轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物呈分散狀態(tài)，無法作用于DNA，從而轉(zhuǎn)錄失活和TIMP-3蛋白表達(dá)受限；當(dāng)TIMP-3對金屬蛋白酶及蛋白聚糖酶的抑制作用減弱或消失后，炎性因子IL-1、TNFα及IL-6對軟骨的破壞作用也減弱或消失，從而軟骨外周基質(zhì)降解增加，最終導(dǎo)致OA的發(fā)生和發(fā)展。

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（收稿日期：2013-08-02 本文編輯：魏玉坡）

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（收稿日期：2013-08-02 本文編輯：魏玉坡）