吳婷婷，魏慶慶，嚴宇鵬，孫穎穎，李莉，胡羅文，馬瑞，李歐，王冀

纈沙坦通過下調X-盒結合蛋白1表達抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡

吳婷婷，魏慶慶，嚴宇鵬，孫穎穎，李莉，胡羅文，馬瑞，李歐，王冀

目的：研究糖尿病心肌?。―CM）模型大鼠心肌組織中X-盒結合蛋白1（XBP1）與心肌細胞凋亡之間的聯(lián)系，以及明確纈沙坦抑制心肌細胞凋亡的作用機制。

糖尿病心肌?。恍募〖毎蛲?；X-盒結合蛋白1；纈沙坦

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:836.)

糖尿病心肌病（DCM）病程中存在著顯著增加的心肌細胞凋亡。內質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡通路，而X盒結合蛋白1（XBP1）作為內質網(wǎng)應激的關鍵信號因子在這一過程中發(fā)揮著重要的調控作用[1-2]。DCM病程中，高血糖、氧化應激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等因素均可誘發(fā)內質網(wǎng)應激，進而導致心肌細胞的凋亡，本研究擬通過建立DCM大鼠模型并采用纈沙坦干預DCM大鼠，觀察XBP1對心肌細胞凋亡的影響以及纈沙坦與XBP1表達水平之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

DCM動物模型的構建：2012-01至2012-08本研究選用清潔級雄性8周齡Wistar大鼠50只（購自山東大學實驗動物中心），體重260～280 g，平均體重（260±18.6 ）g，平均心率 （325±18.0）beats/min，空腹血糖的平均值（4.2±0.9 ）mmol/L，平均收縮壓（125±3.6）mmHg（1mmHg=0.13Pka）。50只大鼠標準大鼠飼料適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為兩部分：腹腔注射65 mg/kg檸檬酸鹽緩沖液（PH 4.5）的大鼠對照組（n=10）; 腹腔注射鏈脲佐菌素65 mg/kg大鼠(n=40)注射7天后，收集大鼠尾靜脈血測空腹血糖，其中37只連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L（300mg/dl）為DCM大鼠建模成功（3只未達成模標準者予以剔除） ②將存留的37只DCM大鼠隨機分為2組： DCM大鼠給予生理鹽水灌胃為DCM組（n=20）, DCM大鼠給予纈沙坦30mg/kg.d灌胃的為DCM+纈沙坦組（n=17）。3組大鼠均再繼續(xù)喂養(yǎng)16周后處死取材，剩余心肌細胞-80℃保存。

實驗大鼠基本指標的監(jiān)測：實驗過程中除常規(guī)每2周測1次體重和血壓，每4周測1次空腹血糖外，分別于鏈脲佐菌素注射后7日及實驗末抽取空腹尾靜脈血測定空腹血糖水平。

超聲心動圖檢測：分別于8周、16周對各組進行常規(guī)超聲心動圖檢查，主要檢測以下指標：心率、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑、左心室射血分數(shù)、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波減速時間、舒張末期左心室后壁厚度、舒張末期室間隔厚度、短軸縮短率、等容舒張時間。

心肌組織病理學檢測：16周后處死動物，進行常規(guī)蘇木素伊紅染色（H&E染色）、Masson三色染色以及天狼星紅染色，觀察心肌組織結構、細胞形態(tài)、膠原分布情況。

末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法（TUNEL染色）：使用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒對石蠟切片進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，細胞核呈現(xiàn)綠色熒光的心肌細胞即為凋亡細胞。

組織免疫熒光染色：取心肌組織石蠟切片，對內質網(wǎng)應激標志分子伴侶葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）進行免疫熒光染色以證實內質網(wǎng)應激的發(fā)生。

蛋白質印跡法（Western blot）檢測：取-80℃保存的心肌組織，分別提取總蛋白和細胞核蛋白，通過10%～15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對等量的蛋白樣品進行分離、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗標記、顯色等，檢測cytochrome c、cleaved caspase 3、GRP78和XBP1-s的表達。

半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和實時定量RT-PCR檢測：Trizol法提取心肌組織總RNA，經(jīng)逆轉錄獲得cDNA，以β-肌動蛋白（β-actin）為參照，通過半定量RT-PCR技術檢測XBP1-s 信使核糖核酸（mRNA）水平的表達，實時定量RT-PCR技術檢測GRP78的 mRNA表達水平。

統(tǒng)計學分析：使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組大鼠的基本指標監(jiān)測：8周時，DCM組與對照組比較，體重下降，心率、空腹血糖和收縮壓升高；DCM+纈沙坦組與DCM組比較，體重降低，心率、空腹血糖和收縮壓降低。16周時，DCM組與對照組比較，體重和心率下降，空腹血糖和收縮壓升高；DCM+纈沙坦組與DCM組比較，體重和心率增加，空腹血糖和收縮壓降低。上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表1

表1 三組大鼠8周和16周后體重、心率、空腹血糖及血壓水平比較

表1 三組大鼠8周和16周后體重、心率、空腹血糖及血壓水平比較

注： 本時間段對照組比較*P＜0.05； 與DCM組比較△P＜0.05。1 mmHg=0.133 Pka #：存活只數(shù) DCM：糖尿病心肌病

收縮壓(mmHg) 8周對照組 10 348±15.3 328±22 4.4±0.8 128±2.8 DCM組 20 272±14.8* 402±5* 19.3±2.0*144±6.4*DCM+纈沙坦組17 312±9.2△ 361±19△17.9±1.2△131±4.0△16周后對照組 10 452±19.0 341±38 4.41±0.5 134±3.0 DCM組# 15 290.3±20.7*308±20* 20.2±1.1*157±7.5*DCM+纈沙坦組 17 389.5±22.3△326±31△18.3±1.5△133±4.7△存活數(shù)(只)體重(g)心率(beats/min)空腹血糖(mmol/L)

三組大鼠16周后超聲心動圖檢測指標比較：DCM組與對照組比較，二尖瓣E波最大速度、二尖瓣E波最大速度/A波最大速度左心室及射血分數(shù)均降低，其余均增加；DCM+纈沙坦組與DCM組比較，二尖瓣E波最大速度、二尖瓣E波最大速度/A波最大速度及左心室射血分數(shù)均升高，其余均降低。上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）表2

心肌組織病理學檢查的比較：① H&E三色染色：對照組心肌細胞排列整齊，大小均一，胞漿染色均勻；DCM組與對照組相比，心肌細胞肥大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂；DCM+纈沙坦組與DCM組相比，細胞肥大減輕，排列較規(guī)則（圖1A）。②Masson染色：對照組心肌膠原纖維排列整齊，心肌小動脈周圍少量膠原沉積，心肌間質內少量膠原組織呈散在、長索條狀分布；DCM組與對照組相比，心肌細胞肥大，排列紊亂，心肌內小血管周圍膠原沉積明顯增多，粗大膠原纖維交聯(lián)成網(wǎng)格狀；DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細胞排列較整齊，心肌間質內和小動脈周圍膠原纖維顯著減少（圖1B）。③天狼星紅染色：DCM組與對照組相比，Ⅰ型及Ⅲ型膠原顯著增加；DCM+纈沙坦組與DCM組相比，膠原纖維含量有所下降（圖1C）。

表2 三組大鼠16周后超聲心動圖檢測指標比較

表2 三組大鼠16周后超聲心動圖檢測指標比較

注：與對照組比較*P＜0.05 與DCM組比較△P＜0.05。 余注見表1

DCM組# (n=15)對照組(n=10) DCM+纈沙坦組(n=17)左心室收縮末期內徑 (cm) 2.2±0.3 4.2±0.3* 3.2±0.4△左心室舒張末期內徑 (cm) 7.0±0.5 10.8±0.4* 8.8±0.3△舒張末期室間隔厚度 ( ms) 37±5.1 52±7.3* 42±7.7△二尖瓣E波最大速度 (E， m/s) 62.1±9.9 41.2±7.1* 56.2±6.1△A波最大速度 (A ，m/s) 31.6±8.7 55.4±7.6* 43.5±7.2△E/A 2.3±0.4 0.9±0.1* 1.5±0.1△E波減速時間 (ms) 70.2±7.8 82.3±5.8* 76.1±5.7△短軸縮短率 ( %) 57.1±5.8 63.1±7.1* 60.6±3.7△射血分數(shù) (%) 85.2±43.0 35.1±6.2* 68.2±0.4△舒張末期室間隔厚度 ( mm) 2.1±0.6 2.8±0.5* 2.3±0.2△舒張末期左心室后壁厚度 (mm) 1.8±0.4 2.6±0.6* 2.1±0.3△

圖1 三組大鼠心肌組織蘇木素伊紅染色、Masson三色染色及天狼星紅染色（20×）

三組大鼠TUNEL染色的結果比較：與對照組相比，DCM組大鼠心肌細胞凋亡顯著增加（圖2B）；DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細胞凋亡明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 圖2C

圖2 三組大鼠心肌組織TUNEL染色（20×）及凋亡的心肌細胞計數(shù)（個）

Western blot檢測在三組大鼠心肌組織中cleaved caspase 3、 cytochrome c蛋白相對表達水平的比較：DCM組大鼠心肌組織中cleaved caspase 3、cytochrome c的蛋白表達水平較對照組顯著上調（P＜0.05），而DCM+纈沙坦組較DCM組的表達水平有所下降（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。 圖3

圖3 三組大鼠心肌組織中cleaved caspase 3、 cytochrome c的蛋白表達水平

免疫熒光技術、實時定量RT- PCR和Western blot檢測三組大鼠心肌組織中GRP78的mRNA及蛋白相對表達水平的比較：DCM組大鼠心肌組織中GRP78 mRNA及其蛋白表達水平較對照組顯著上調（圖4B，圖5），DCM+纈沙坦組較DCM組的表達水平有所下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 圖4C、圖5

圖5 實時定量RT- PCR 和Western blot 檢測GRP78的mRNA及蛋白在三組大鼠心肌組織中的相對表達水平

半定量RT-PCR 和Western blot 檢測XBP1-s mRNA及蛋白在三組大鼠心肌組織中的相對表達水平的比較：大鼠心肌組織中XBP1-s mRNA及其蛋白表達，DCM組與對照組相比，顯著增加； DCM+纈沙坦組與DCM組相比有所下降。上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 圖6

圖6 半定量RT-PCR和Western blot檢測XBP1-s mRNA及蛋白在三組大鼠心肌組織中的相對表達水平的比較

3 討論

DCM被認為是一種與糖尿病相關的心肌結構改變及功能異常。在DCM病程中，心肌細胞內環(huán)境紊亂，細胞凋亡的程度逐漸超過了細胞增殖的速度，使得心肌凋亡的范圍增大，組織細胞大量喪失，最終導致心功能的嚴重減退[3,4]。細胞凋亡的調節(jié)機制包括一系列復雜的級聯(lián)反應，其中內質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡通路近年來受到越來越多的關注，本研究通過構建DCM大鼠動物模型，利用GRP78的表達水平反映內質網(wǎng)應激的激活，檢測細胞凋亡相關因子cleaved caspase 3和cytochrome c的表達水平，驗證了在DCM病程中存在著內質網(wǎng)應激介導的心肌細胞凋亡。

XBP1是一種新發(fā)現(xiàn)的與蛋白折疊及內質網(wǎng)構建相關的蛋白質，是內質網(wǎng)應激的關鍵信號調控因子[5]。在內質網(wǎng)應激過程中，XBP1mRNA經(jīng)過需肌醇酶1依賴性的剪接，轉錄形成由376個氨基酸構成的XBP1-s。后者持續(xù)高表達，將可能導致心肌細胞凋亡的顯著增加[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DCM大鼠心肌組織中存在XBP1-s表達增加，同時細胞凋亡相關因子cleaved caspase 3和cytochrome c表達上調，表明心肌細胞凋亡增加，這證實了XBP1-s的持續(xù)表達可導致DCM心肌細胞凋亡增加。

纈沙坦是一種高選擇性血管緊張素Ⅱ 1型受體拮抗劑，除降壓作用外，還可通過特異性阻斷血管緊張素Ⅱ與血管緊張素Ⅱ 1型受體的結合，最大限度阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活，消除血管緊張素Ⅱ對血壓和心功能的不利影響，在臨床上被廣泛的用于降低血壓和治療其他血管緊張素Ⅱ引起的心血管事件[9,10]。相關研究發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠早期即存在著心肌細胞重構與凋亡[11,12]。本研究使用纈沙坦對DCM大鼠進行早期干預發(fā)現(xiàn)：纈沙坦可以有效減少DCM大鼠的心肌細胞凋亡，并且纈沙坦干預組中內質網(wǎng)應激的調控因子XBP1、內質網(wǎng)應激標志物GRP78的表達水平均顯著下調，這表明纈沙坦減少心肌細胞凋亡的作用與抑制XBP1所介導的內質網(wǎng)應激有關。

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Valsartan Inhibits Myocardial Apoptosis by Down-regulating Myocardial X-box Binding Protein 1 Expression in Experimental Diabetic Cardiomyopathy Rat’s Model

WU Ting-ting, WEI Qing-qing, YAN Yu-peng, SUN Ying-ying, LI Li, HU Luo-wen, MA Rui, LI Ou, WANG Ji.
Intensive Care Unit, China Meitan General Hospital, Beijing (100028), China

WANG Ji, Email: sdwhdz@hotmail.com

Objective: To study the relationship between myocardial X-box binding protein 1 (XBP1) expression and myocardial apoptosis in experimental diabetic cardiomyopathy (DCM) rat’s model and to clarify the mechanism of valsartan inhibiting myocardial apoptosis.Methods: A total of 50 Wistar rats were divided into 2 groups: Control group, the rats received intraperitoneal citrate buffer at 65mg/kg, n=10 and Streptozotocin group, the rats received intraperitoneal streptozotocin at 65mg/kg, n=40, all animals were treated for 7 days. DCM model was established in 37 rats (fasting blood glucose ≥ 16.7mmole/L) and they were further divided into 2 groups: DCM group, the rats received intragastric normal saline, n=20 and DCM + valsartan group, the rats received intragastric valsartan at 30mg/kg.day, n=17. The rats were treated for 16 weeks. The body weight, tail blood pressure, glucose and cardiac function were compared among 3 groups. Myocardial apoptosis was detected by TUNEL staining, RNAand protein expressions of myocardial cytochrome C, cleaved caspase 3, glucose regulation protein 78 (GRP78) and XBP1-s were examined by immunof l uorescence, real time RT-PCR and Western blot analysis.Results: Compared with Control group, DCM group showed disordered cardiac structure, more collagen content and myocardial apoptosis, P＜0.05; increased RNA and protein expressions of GRP78, XBP1-s, cleaved caspase 3 and cytochrome C, P＜0.05. Compared with DCM group, DCM + valsartan group had rather regularly arranged myocardiocytes, less interstitial fi brosis and myocardial apoptosis, P＜0.05; decreased RNA and protein expressions of GRP78, XBP1-s, cleaved caspase 3 and cytochrome C, P＜0.05.Conclusion: Valsartan may inhibit myocardial XBP1 activation and therefore, reduce the myocardial apoptosis in experimental DCM rat’s model.

Diabetic cardiomyopathy; Myocardial apoptosis; X-box binding protein 1; Valsartan

2013-11-20）

（助理編輯：曹洪紅）

100028 北京市，煤炭總醫(yī)院 重癥醫(yī)學科

吳婷婷 主治醫(yī)師 博士 主要從事心血管重癥的診療及分子生物學研究 Email：wutingtingfive@sina.com 通訊作者：王冀Email：sdwhdz@hotmail.com

R541

A

1000-3614（2014）10-0836-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.10.0019

方法：將清潔級雄性8周齡Wistar大鼠50只隨機分為兩部分：腹腔注射65 mg/kg的檸檬酸鹽緩沖液的大鼠為對照組（n=10）; 腹腔注射鏈脲佐菌素65 mg/kg大鼠（n=40）注射7天后，收集大鼠尾靜脈血測空腹血糖，其中37只連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L（300mg/dl）為DCM大鼠建模成功并將其隨機分為2組：給予以生理鹽水灌胃的為DCM組（n=20）,以30mg/kg.d灌胃纈沙坦給藥的為DCM+纈沙坦組（n=17）。三組大鼠飼養(yǎng)過程中檢測體重、血糖、血壓、心功能等指標變化。大鼠16周后處死觀察心肌組織結構、細胞形態(tài)、膠原分布情況，TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡，并通過免疫熒光、蛋白印跡法（Western blot）、實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及半定量RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中cytochrome c、cleaved caspase 3、葡萄糖調節(jié)蛋白78（GPR78）和剪接型XBP1（XBP1-s）表達水平。

結果：DCM組大鼠與對照組相比，心肌結構紊亂，膠原含量明顯增加，心肌細胞凋亡增加（P＜0.05），GRP78、XBP1-s、cleaved caspase 3和cytochrome c蛋白及核糖核酸（RNA）表達水平明顯升高（P＜0.05），DCM+纈沙坦組與DCM組相比，心肌細胞排列較整齊，心肌間質內和小動脈周圍膠原纖維顯著減少，心肌細胞凋亡明顯減少（P＜0.05），GRP78、XBP1-s、cleaved caspase 3和cytochrome c蛋白及RNA表達水平明顯下降（P＜0.05）。

結論：DCM大鼠心肌組織中存在著調節(jié)內質網(wǎng)應激的關鍵因子-XBP1的活化，DCM病程中存在著XBP1調控的內質網(wǎng)應激相關凋亡途徑的激活，心肌細胞凋亡增加，而纈沙坦能夠抑制DCM大鼠心肌細胞XBP1的激活，減少心肌細胞凋亡。