于曉東，李瑩，張鳳香

鈣敏感受體對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過程的影響及機(jī)制研究*

于曉東，李瑩，張鳳香

目的：研究鈣敏感受體（CaR）在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞的影響。

鈣敏感受體；巨噬細(xì)胞 ；CD36；膽固醇?；D(zhuǎn)移酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:828.)

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是由多種因素作用產(chǎn)生的復(fù)雜的病理變化，其中巨噬細(xì)胞的泡沫化轉(zhuǎn)變?cè)贏S的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了十分重要的作用。因此，如何抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞已經(jīng)成為了近些年研究的重點(diǎn)。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor, CaR）是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C家族的一員，它廣泛存在于冠狀動(dòng)脈、腎動(dòng)脈和主動(dòng)脈等心血管系統(tǒng)中，并與AS的形成和發(fā)展有密切聯(lián)系[1]。但CaR在巨噬細(xì)胞中是否存在表達(dá)，以及CaR對(duì)巨噬細(xì)胞的泡沫化過程是否能產(chǎn)生影響尚知甚少。本實(shí)驗(yàn)主要探討CaR在巨噬中的表達(dá)情況，以及對(duì)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變的影響。

1 材料和方法

材料：2013-03至2013-09人巨噬細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)）；CaR激動(dòng)劑（GdCl3） 、CaR 抑制劑（NPS2390，上海生工公司）；氧化低密度脂蛋白（oxLDL，北京生物技術(shù)公司）；DMEM胎牛血清（美國(guó) Hyclone 公司）；兔抗鼠CaR抗體、兔抗鼠膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（ACAT-1）單克隆抗體、兔抗鼠CD36單克隆抗體、小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin ）單克隆抗體 、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋公司）；免疫熒光染色試劑盒-FITC（美國(guó)Santa Cruz公司）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA，試劑盒為美國(guó)ADL 公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)、泡沫化處理及分組：人巨噬細(xì)胞置于 37℃水浴中 1 min 內(nèi)快速?gòu)?fù)蘇，細(xì)胞在含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng), 置于37℃、5% CO2 孵箱中，每隔 3～5 天傳代一次，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入100 mg/L ox-LDL培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成。將誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞分為3組（各組n=6）：空白對(duì)照組；CaR激動(dòng)劑（GdCl3）組；CaR抑制劑（NPS2390）組?？瞻讓?duì)照組只加培養(yǎng)基，而CaR激動(dòng)劑組和CaR抑制劑組分別加入GdCl3和NPS2390，然后連續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組泡沫細(xì)胞備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

免疫熒光染色檢測(cè)CaR蛋白的定位表達(dá)：巨噬細(xì)胞在經(jīng)4%多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片上培養(yǎng)，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗（NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，Na2HPO43.628 g，溶于800 ml蒸餾水中， pH=7.4），4%的甲醛固定30 min，山羊血清37℃下，封閉30 min；CaR抗體孵育，4℃過夜；PBS沖洗3次；FITC-標(biāo)記的抗鼠IgG孵育，37℃1 h; 4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，2-（4-amidinophenyl）-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI）染核，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下觀察。

油紅 O 染色：細(xì)胞培養(yǎng)于預(yù)先放有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，待處理好后，用PBS洗3次，60%異丙醇固定1 min，PBS洗1次，油紅O染色細(xì)胞10 min，PBS洗3 次，每次1 min，蘇木素復(fù)染2 min，1%鹽酸酒精分色1 s，水性封片劑封片。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴[2]。

高效液相色譜（HPLC）分析：用0.9% NaCl離心洗滌2遍，棄上清，加0.9% NaCl 500 μl重懸細(xì)胞，冰浴中超聲裂解細(xì)胞。4℃，15000 g/min，離心10 min，進(jìn)行蛋白定量。余下上清加入150 μl內(nèi)標(biāo)液，渦旋混勻。將混合物分成等量的兩份，加入等體積的新鮮配制的15% KOH醇溶液，50℃水浴2 h。然后加正己烷，振蕩器上渦旋混勻。取上層有機(jī)相在真空干燥機(jī)中真空干燥。沉淀中加入丙酮和CrO3。正己烷終止反應(yīng)，加水混勻，取上層有機(jī)相300 μl放于真空干燥機(jī)中真空干燥。加入100 μl異丙醇：正庚烷：乙腈（35：12：52，v/v） 將樣本溶解，活性碳去色素；超聲除氣，1500 g/min離心 5 min，收集上清液；取10 μl進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析[2,3]。

ELISA 檢測(cè)：取出實(shí)驗(yàn)所需板條，留空白孔。加0.1 ml離心后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液于反應(yīng)孔中，置37℃孵育90 min，然后洗板5次。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1 ml，37℃孵育1 h，洗板5次。加酶結(jié)合工作液0.1 ml，37℃避光孵育30 min，洗板5次。加入0.1 ml顯色底物液，37℃避光孵育15 min：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.1 ml，混勻后即可測(cè)量光密度（OD）450值。

蛋白印跡（Western blot） 檢測(cè)： 泡沫細(xì)胞收集后用PBS洗2次，裂解緩沖液[20 mmol/ L Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl、1% Triton x-100、0.1% 十二烷基磺酸鈉（SDS）、1%脫氧膽酸鈉、1 mmol/L 依地酸二鈉（EDTA）、1 mmol/L PMSF、1 μg/ml aprotinin、1 mmol/L Na3VO4 ]提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量。煮沸變性，每孔加40 μg樣本，濃縮膠6%，分離膠10% SDS-PAGE電泳分離，恒壓電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜, 5%脫脂牛奶封閉1 h。兔抗鼠CaSR（1:3000）、兔抗鼠CD36（1:500）、兔抗鼠ACAT-1（1:1000），4℃過夜。反復(fù)洗膜，后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗 IgG 抗體（ 1:1000）孵育，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

巨噬細(xì)胞中CaR的表達(dá)情況： Western blot結(jié)果顯示，加入CaR抗體的巨噬細(xì)胞可見明顯條帶出現(xiàn)，而未加入CaR抗體的的巨噬細(xì)胞未見任何條帶（圖1A）。免疫熒光結(jié)果顯示，未加入CaR抗體的巨噬細(xì)胞僅見核藍(lán)染（圖1B）；而加入CaR抗體的巨噬細(xì)胞的胞膜與胞漿內(nèi)均有特異性綠色熒光，DAPI將核染為藍(lán)色。以上結(jié)果說(shuō)明CaR在巨噬細(xì)胞中存在表達(dá)。圖1B、1C

圖1 蛋白印跡和免疫熒光法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CaR的表達(dá)情況

高效液相色譜（HPLC）分析各組泡沫細(xì)胞膽固醇代謝結(jié)果：各組作用細(xì)胞48 h后，油紅O染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率為（54.12±4.23）%； CaR激動(dòng)劑組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率為（21.97±2.04）%； CaR抑制劑組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率為（87.69±6.67）%。HPLC結(jié)果顯示：CaR抑制劑組的膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇、膽固醇酯/總膽固醇值顯著高于空白對(duì)照組，而CaR激動(dòng)劑組的膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇、膽固醇酯/總膽固醇值顯著低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0. 05） 。表1

表1 高效液相色譜分析各組泡沫細(xì)胞膽固醇代謝結(jié)果(mg/g, n=6,

表1 高效液相色譜分析各組泡沫細(xì)胞膽固醇代謝結(jié)果(mg/g, n=6,

注：與空白對(duì)照組比較*P＜0.05 。CaR：鈣敏感受體

分組 膽固醇酯 游離膽固醇 總膽固醇 膽固醇酯/總膽固醇(%)空白對(duì)照組 56.27±5.16 41.96±3.88 72.64±7.42 77.62±6.12 CaR激動(dòng)劑組 11.02±2.14* 14.36±2.51*26.57±3.62* 41.56±2.67*CaR抑制劑組 81.34±5.97* 59.23±4.16*98.42±9.65*88.81±7.23*

CaR對(duì)泡沫細(xì)胞上清液中炎性因子分泌的影響：各組作用細(xì)胞48 h后，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較， CaR激動(dòng)劑組腫瘤壞死因子-a（TNF-α） 和巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）水平明顯降低，而白介素-10（ IL-10）水平明顯升高 （P＜0.05）； CaR抑制劑組 TNF-α和 MIF水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低 （P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2

表2 CaR對(duì)泡沫細(xì)胞上清液中炎性因子分泌和CD36、ACAT-1蛋白表達(dá)的影響(mg/g, n=6,

表2 CaR對(duì)泡沫細(xì)胞上清液中炎性因子分泌和CD36、ACAT-1蛋白表達(dá)的影響(mg/g, n=6,

注：與空白對(duì)照組比較*P＜0.05。ACAT-1膽固醇?；D(zhuǎn)移酶。余注見表1

指標(biāo) 空白對(duì)照組 CaR激動(dòng)劑組 CaR抑制劑組炎性因子腫瘤壞死因子-α 61.31±4.28 43.67±3.76* 79.64±5.03*巨噬細(xì)胞游走抑制因子 53.67±4.96 35.21±3.43* 71.44±5.32*白細(xì)胞介素-10 56.25±4.66 72.31±4.78* 40.63±4.01*CD36 0.32±0.02 0.21±0.02* 0.49±0.03*ACAT-1 0.59±0.04 0.41±0.03* 0.73±0.04*

CaR對(duì)泡沫細(xì)胞中CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)的影響 ：各組作用細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較， CaR激動(dòng)劑組CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)明顯降低，而CaR抑制劑組CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2、圖2

圖2 蛋白印跡檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CD36和ACAT-1蛋白的表達(dá)

3 討論

泡沫細(xì)胞是由單核巨噬細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)后得以形成的，它是AS的顯著特征。泡沫細(xì)胞可以通過大量釋放游離膽固醇和膽固醇酯，并使其聚集在血管壁的損傷處，從而形成AS斑塊的脂質(zhì)核心。泡沫細(xì)胞還可以通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶等炎癥介質(zhì)，促進(jìn)斑塊局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，降低斑塊穩(wěn)定性，引起斑塊破裂和脫落，最終導(dǎo)致缺血性心血管疾病的形成[4]。

本研究通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞內(nèi)CaR抗體組出現(xiàn)170 kD特異性條帶，而陰性對(duì)照組無(wú)任何條帶出現(xiàn)。免疫熒光染色顯示，CaR蛋白定位在巨噬細(xì)胞的胞膜和胞漿。以上結(jié)果說(shuō)明巨噬細(xì)胞內(nèi)有CaR的表達(dá)。研究表明CaR在AS的形成和發(fā)展中起重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CaR對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響。本研究發(fā)現(xiàn)；與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑組的細(xì)胞陽(yáng)性率和總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯值均明顯降低，而CaR抑制劑組的細(xì)胞陽(yáng)性率和總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯值均明顯升高。該結(jié)果說(shuō)明當(dāng)CaR的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被明顯抑制。TNF-α可以通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)凝血和抑制纖溶等作用來(lái)促進(jìn)AS的形成[5,6]。MIF可以通過抑制巨噬細(xì)胞的游走和促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎性反應(yīng)區(qū)域的聚集、增生和分 泌細(xì) 胞 因 子等作用來(lái)促進(jìn)AS的形成[7]。而 IL-10則可以通過抑制單核巨噬細(xì)胞合成及釋放各種炎性因子和抑制炎性細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)等作用來(lái)抑制AS的形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑組TNF-α和MIF 水平明顯降低，而IL-10水平明顯升高；CaR抑制劑組TNF-α和MIF水平明顯升高，而 IL-10水平明顯降低。該研究結(jié)果說(shuō)明， 高表達(dá)的CaR具有促進(jìn)抗炎因子分泌和抑制促炎因子分泌的作用。CD36是單核巨噬細(xì)胞表面的一種清道夫受體，巨噬細(xì)胞可以通過CD36攝取大量ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而影響AS的形成[9-11]。ACAT-1可以使細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减?，而大量蓄積的膽固醇酯則可以使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞[12]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑組CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)明顯降低，而CaR抑制劑組CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)明顯升高。該研究結(jié)果說(shuō)明，高表達(dá)的CaR可以通過下調(diào)泡沫細(xì)胞形成基因CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)來(lái)抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。

綜上,巨噬細(xì)胞中存在CaR的表達(dá)，并且CaR的表達(dá)變化可以影響巨噬細(xì)胞泡沫化的形成，但其具體機(jī)制還需做進(jìn)一步的研究。

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Effect of Calcium-sensing Receptor on Human Macrophages Converting to Foam Cells With its Mechanisms

YU Xiao-dong, LI Ying, ZHANG Feng-xiang.
Department of Cardiac Surgery, First Aff i liated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou (121001), Liaoning, China

ZHANG Feng-xiang, Email: zhangfengxiang64@163.com

Objective: To study the expression of calcium-sensing receptor (CaR) in human macrophages and the effect of CaR on macrophages converting to foam cells with its mechanism.Methods: Human macrophages were treated with ox-LDL (100 mg/L) for 48 h to induce foam cell formation, the experimental foam cells were cultured in 3 groups for 48 h respectively. Blank control group, Foam cell + CaR agonists (Agonists) group and Foam cell + CaR inhibitor (Inhibitor) group. The CaR expression in macrophages was measured by immuno-fluorescence and Western blot analysis. The positive foam cell formation was detected by oil red O staining, the intracellular cholesterol metabolism in foam cell was observed by HPLC, the inf l ammatory cytokine secretion in foam cell culture supernatant was examined by ELISA, the protein expressions of CD36 and acyl-coA: cholesterol acyl-transferase (ACAT-1) in foam cells was measured by Western blot analysis.Results: Immuno-f l uorescence and Western blot indicated CaR is expressed in human macrophages. Compared with Control group, Oil Red O staining and HPLC showed that Agonists group had less positive foam cell formation, decreased CE, FC , TC, and Inhibitor group had more positive foam cell formation, increased CE, FC, TC, all P＜0.05; ELISA presented that Agonists group had decreased TNF-α, MIF, increased anti-inflammatory cytokine IL-10, and Inhibitor group had increased TNF-α, MIF, decreased IL-10, all P＜0.05; Western blot analysis indicated that Agonists group had decreased protein expressions of CD36, ACAT-1in foam cells, and Inhibitor group had increased protein expressions of CD36 and ACAT-1.Conclusion: CaR is expressed in human macrophages, the higher CaR expression may inhibit macrophages converting to foam cells.

Calcium-sensing receptor; Macrophages; CD36; Acyl coA: cholesterol acyl-transferase

2014-01-16)

（編輯：梅平）

遼寧省自然科學(xué)基金（2013022010）；遼寧醫(yī)學(xué)院青年科技啟動(dòng)基金項(xiàng)目 (XZJJ20130246) ；遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院青年科技啟動(dòng)基金項(xiàng)目 (FY2012-07)

121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心外科

于曉東 碩士研究生 主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究 Email: canghaiguanri@126.com 通訊作者：張鳳香 Email: zhangfengxiang64@163.com

R541

A

1000-3614（2014）10-0828-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.10.017

方法: 通過免疫熒光和蛋白印跡（Western Blot）檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CaR的表達(dá)情況；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）100 mg/L作用48 h，使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分組為CaR激動(dòng)劑組、CaR抑制劑組、空白對(duì)照組，分別作用泡沫細(xì)胞48 h：采用油紅O染色檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量；高效液相色譜觀察細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝情況；酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎性因子的分泌情況；Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD36和膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（ACAT-1）蛋白的表達(dá)情況。

結(jié)果: Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示在巨噬細(xì)胞中存在CaR的表達(dá)。油紅O染色和高效液相色譜檢測(cè)泡沫細(xì)胞的結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇的含量均明顯下降（P＜0.05），而CaR抑制劑組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇的含量均明顯升高（P＜0.05）；ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑組促炎因子腫瘤壞死因子-（TNF- a）、巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）含量明顯降低（P＜0.05），抗炎因子白細(xì)胞介素-10（IL-10） 含量明顯升高（P＜0.05），而CaR抑制劑組促炎因子TNF- a、 MIF 含量明顯升高（P＜0.05），抗炎因子IL-10含量明顯降低（P＜0.05）；Western blot檢測(cè)各組泡沫細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組比較，CaR激動(dòng)劑組CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)明顯下降，而CaR抑制劑組CD36和ACAT-1蛋白表達(dá)明顯升高。

結(jié)論: 在巨噬細(xì)胞中存在CaR的表達(dá)，并且高表達(dá)的CaR可以抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的形成。