趙艷霞，李玉紅，王亞平，楊應忠，馬蘭，格日力

低氧聯合高脂飲食對SD大鼠心肌內皮型一氧化氮合酶/一氧化氮的影響*

趙艷霞，李玉紅，王亞平，楊應忠，馬蘭，格日力

目的：本研究旨在探討低氧聯合高脂飲食對SD大鼠心肌內皮型一氧化氮合酶（eNOS）/一氧化氮（NO）的影響及其可能機制。

低氧；高脂飲食；內皮型一氧化氮合酶；一氧化氮

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:723.)

一氧化氮（NO）是一氧化氮合酶（NOS）催化產生的一種細胞信號分子，具有擴張血管、抑制平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集等作用，可調節(jié)心血管張力、維持血管穩(wěn)態(tài)，調控心肌細胞收縮、氧耗、肥大和凋亡等。因而NO對心肌正常結構和功能有多重保護作用[1-2]。一氧化氮是高原適應與習服的重要指標[3]，高原世居藏族循環(huán)血中NO代謝產物高于低海拔人群的水平，可增加血流灌注及氧傳遞，以抵消低氧影響[4]，而機體NO含量降低則可引起高原適應不良。高脂血癥亦影響NO含量[5]，慢性低氧可引起血脂異常[6]。高脂血癥對低氧環(huán)境（高原環(huán)境及慢性低氧性疾?。┤巳盒募〈嬖谠鯓拥挠绊懮胁皇置鞔_。本研究分析高脂飲食對低氧環(huán)境SD大鼠心肌組織內皮型一氧化氮合酶（eNOS）/一氧化氮（NO）的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

實驗動物：60只6周齡，體重180～200 g，清潔級雄性SD大鼠（中國藥科大學提供）隨機分為三組（每組20只）：常氧組（南京，海拔10米）、低氧組（模擬海拔5000米，低壓氧艙）、低氧聯合高脂飲食組（模擬海拔5000米，低壓氧艙），低氧聯合高脂飲食組大鼠灌服脂肪乳劑（10 ml/（kg.d），1次/天），另外兩組大鼠灌服等體積生理鹽水，普通飲食。于實驗4周末取材，抽取大鼠外周靜脈血置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）抗凝管，留取心肌標本于-80℃冰箱保存。

主要儀器和試劑：低壓氧艙室（貴州風雷航空機械有限公司，DYC-3000），BC-2300全自動血細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司），ABI7500熒光實時定量PCR儀（美國，ABI公司），分光光度計（北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司），DU800核酸蛋白儀、冷凍離心機（德國，BECKMAN），高速組織勻漿機（德國，Miccra D-8）。一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物公司），血脂檢測試劑盒（北京利德曼生化股份有限公司），BCA蛋白分析試劑盒（USA Pierce Chemical Company），離心柱型-總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），eNOS及β肌動蛋白（β-actin）一抗（美國，Abcam公司），二抗（美國，Santa Cruz Biotechnology lnc公司），無創(chuàng)血壓計—鼠儀（BP2010AUL，北京軟隆科技有限責任公司）

脂肪乳劑：脂肪乳劑制備參考文獻[7]，取豬油25 g放于200 ml燒杯內，置磁力攪拌器上加熱至100℃，加膽固醇10 g，溶化, 再加丙基硫氧嘧啶1 g，然后加25 g吐溫80，充分攪勻制成油相。于另一200 ml燒杯中加蒸餾水30 ml、丙二醇20 ml，加熱至60 ℃，然后加脫氧膽酸鈉2 g，充分攪拌至完全溶解，制成水相。將水相加入油相，充分混勻，即成脂肪乳劑。

1.2測量指標

①心肌病理形態(tài)觀察：取心肌標本固定，脫水，包埋，切片，蘇木精伊紅（HE）染色，觀察心肌病理形態(tài)改變。②靜脈全血血紅蛋白濃度測定：使用血細胞分析儀檢測靜脈全血血紅蛋白濃度。③血漿丙二醛含量和超氧化物歧化酶活力測定：將抗凝血離心（3000 r/min）10 min，分離血漿，用TBA比色法測定MDA含量[8]，WST-1法測定SOD活力[9]。④血脂水平檢測：采用終點法檢測血漿總膽固醇（TCH）及甘油三酯（TG）含量，直接測定法檢測血漿高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）含量[10]。⑤心肌硝酸鹽/亞硝酸鹽（NOX）水平檢測：采用硝酸還原酶法檢測心肌NOX水平[11]，間接反映心肌NO含量。⑥心肌eNOS mRNA水平檢測：用離心柱法提取總RNA，按照TaKaRa FastQuant RT Kit說明逆轉錄合成cDNA，引物序列為eNOS[12]上游：5'-CTACCGGGACGAGGTACTGG-3'，下游：5'-GGAAAAGGCGGTGAGGACTT-3'，β-actin[13]上游：5'-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTT-3'。 ⑦ Realtime PCR反應體系（20 μl）：滅菌雙蒸水7.2 μl，2×SYBR Select Master Mix 10 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。于PCR儀中進行，每樣品設3個重復孔，目的基因和內參基因的PCR反應條件一致，Holding stage：50℃ 2 min，95℃ 2 min；Cyclingstage：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。用ABI Prism 7500軟件采集并分析數據，采用2-△△Ct法計算。⑧心肌eNOS蛋白水平檢測：將心肌組織切成小塊，加入蛋白裂解液裂解組織、勻漿、離心，取上清液，用BCA蛋白分析試劑盒檢測樣品總蛋白濃度[14]。提取蛋白用5×蛋白上樣緩沖液于100℃變性5 min。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，每泳道上樣蛋白量為80 μg。用半干轉印槽（BioRad，USA）轉印蛋白至PVDF膜上，之后用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入兔抗eNOS（1:250），兔抗β-actin（1:1000），于4℃孵育過夜。洗膜后加入經辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1:6000），室溫孵育2 h，之后使用ECL液發(fā)光顯影，掃描膠片后，采用Image J軟件對凝膠圖像蛋白表達條帶積分光密度值進行分析，并計算eNOS與β-actin條帶積分光密度值的相對比值。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數據用均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

心肌病理形態(tài)變化：常氧組心肌結構正常，心肌細胞平行排列，核位于中央，胞內可見清楚的橫紋； 低氧組心肌細胞增大，橫紋結構不明顯，胞漿疏松，有空泡，細胞間隙增寬，間質大量充血，內皮細胞腫脹；低氧聯合高脂飲食組心肌細胞排列紊亂，橫紋結構不清，胞漿疏松，局部細胞出現自溶現象，心肌細胞內及肌束間出現大小不一中等量空泡，間質充血。圖1

圖1 心肌病理形態(tài)變化

靜脈血紅蛋白濃度測定：全自動血細胞分析儀測定大鼠靜脈血紅蛋白濃度，結果顯示低氧組組與低氧聯合高脂飲食組大鼠靜脈血紅蛋白濃度[(225.88±45.26) g/L，(196.88±34.11) g/L]明 顯 高于常氧組 (144.63±13.13) g/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明低壓氧艙模擬海拔5000米建造慢性重度低氧大鼠模型成功，模型可用于實驗研究。

血脂水平檢測：血脂檢測結果顯示低氧聯合高脂飲食組TC、LDL含量[（2.36±0.22） mmol/L，（0.91±0.04）mmol/L]明顯高于常氧組[（1.56±0.10）mmol/L，（0.25±0.03） mmol/L]與低氧組[（1.55±0.10）mmol/L，（0.26±0.03） mmol/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。低氧組與低氧聯合高脂飲食組的HDL含量[（0.37±0.05） mmol/L，（0.36±0.04） mmol/L]明顯低于常氧組[（0.65±0.07） mmol/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；三組間TG水平[常氧組（0.61±0.07）mmol/L，低氧組（0.54±0.06） mmol/L，低氧聯合高脂飲食組（0.54±0.08） mmol/L] 差異無統(tǒng)計學意義。圖2

圖2 三組大鼠的血脂水平變化

心率、血壓測定：心率檢測結果顯示低氧聯合高脂飲食組大鼠心率[（325.25±57.04）次/min]明顯低于常氧組[（479.35±25.35）次/min]與低氧組[（465.69±22.95） 次/min，P＜0.01]；常氧組與低氧組大鼠心率無明顯差異。血壓檢測結果顯示各組大鼠收縮壓/舒張壓[常氧組、低氧組及低氧聯合高脂飲食組的收縮壓/舒張壓分別為（120.56±13.44）/（93.63±11.84） mmHg，（122.13±5.08）/（95.06±5.41）mmHg，（114.63±15.63）/（89.38±16.47）mmHg，1 mmHg=0.133 kPa]差異均無統(tǒng)計學意義。

血漿丙二醛水平、超氧化物歧化酶活力的測定：MDA含量檢測結果顯示，低氧組大鼠靜脈血MDA含量[（6.49±0.87） nmol/ml]明顯高于常氧組[（4.39±0.7 ）nmol/ml]與低氧聯合高脂飲食組[（4.31±1.73） nmol/ml]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；常氧組與低氧聯合高脂飲食組MDA含量無明顯差別。三組大鼠血漿SOD活力測定結果顯示，與常氧組[（167.02±8.38） U/ml]比較，低氧組[（178.79±16.85） U/ml]與低氧聯合高脂飲食組[（163.89±8.16） U/ml]的SOD活力無明顯變化，而與低氧組比較，低氧聯合高脂飲食組的SOD活力明顯降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。

心肌NOx水平測定：三組大鼠心肌NOx含量檢測結果顯示，低氧組[（4.63±1.15）μmol/gprot]與低氧聯合高脂飲食組[（1.19±0.57）μmol/gprot]大鼠NOx含量明顯低于常氧組[（19.00±1.95）μmol/gprot]，低氧聯合高脂飲食組NOx含量明顯低于低氧組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。

心肌一氧化氮合酶mRNA水平測定：熒光實時定量檢測eNOS mRNA表達水平，采用2-△△Ct法計算， 低氧組（1.79±0.31）與低氧聯合高脂飲食組（2.33±0.80）eNOS mRNA表達水平明顯高于常氧組（1.04±0.32），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而與低氧組比較，低氧聯合高脂飲食組eNOS mRNA表達水平無明顯變化。

心肌一氧化氮合酶蛋白表達水平測定：三組大鼠心肌eNOS 蛋白表達水平檢測結果顯示，低氧組與低氧聯合高脂飲食組eNOS 蛋白表達水平（0.78±0.08，0.74±0.07）明顯高于常氧組（0.52±0.11），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而低氧組與低氧聯合高脂飲食組eNOS 蛋白表達水平無明顯變化。圖3

圖3 蛋白印跡法測定三組大鼠心肌一氧化氮合酶蛋白表達水平

3 討論

本研究通過檢測心肌eNOS mRNA與蛋白表達及NOx含量（間接反映NO含量），探討低氧聯合高脂飲食對SD大鼠心肌eNOS/NO的影響及其機制。結果顯示，相對于常氧組，低氧組與低氧聯合高脂飲食組心肌eNOS mRNA及蛋白表達水平明顯升高，但二者間無顯著差別；相對于低氧組，低氧聯合高脂飲食組心肌NOx含量明顯降低，血漿TC及LDL明顯升高，血漿膜脂質過氧化產物MDA和SOD活力降低，表明高脂飲食加重了低氧環(huán)境大鼠心肌損傷。

低氧組大鼠心肌NOx含量明顯低于常氧組，表明慢性重度低氧（于低壓氧艙模擬海拔5 000米）降低心肌NOx含量，該結果與以往研究一致[15]。一氧化氮是高原適應與習服的重要指標[3]，高原世居藏族循環(huán)血中NO代謝產物高于低海拔人群的水平，可增加血流灌注及氧傳遞，以抵消低氧影響[4]。而NOx含量降低加重內環(huán)境低氧，因心肌NOx含量降低影響血管內皮細胞功能，使其釋放的縮血管物質增多，擴血管物質減少，血管收縮及舒張功能障礙，心肌舒張異常，使心肌供血減少，引起心臟結構和功能損傷[16]。低氧聯合高脂飲食組心肌NOx含量明顯低于低氧組，聯合因素致使NO含量進一步降低，減弱其對心血管的保護作用，加重低氧對心血管損傷。提示對于身處慢性重度低氧環(huán)境或患低氧性疾病人群，高脂血癥可能是其心肌損傷加重的獨立危險因素，應予以預防和治療。

本實驗中低氧聯合高脂飲食組大鼠血漿TCH及LDL明顯高于低氧組，血漿TCH及LDL濃度升高可誘導小窩蛋白，降低eNOS從質膜上解離，從而降低eNOS酶活性[17]，即eNOS蛋白及mRNA表達不降低而NO產生減少的原因之一。另外，血脂異?？梢饳C體抗氧化能力降低，即反映抗氧化作用的指標SOD活力降低。SOD可清除機體代謝過程中產生的超氧陰離子等過氧化物。超氧陰離子等可引起eNOS脫偶聯。eNOS脫偶聯即eNOS不再是同源二聚體結構，而是單體結構，使其不再產生NO，而生成的超氧陰離子可氧化NO為過氧亞硝基陰離子，后者氧化性更強，可氧化eNOS輔因子使其數量減少或功能障礙，導致更多的eNOS脫偶聯，進而降低NO的生成[18]。此外，超氧陰離子可與NO反應，直接清除NO，降低NO水平與生物利用度。SOD可清除過氧化物而保持NO的含量及作用。本研究中低氧組大鼠血漿氧化壓力指標MDA含量升高，即單純低氧可通過氧化壓力升高降低NO含量[15]；低氧聯合高脂飲食組大鼠血漿MDA含量未高于常氧組，即復合因素并未引起氧化壓力的疊加，而血漿SOD活力明顯降低，減弱了其對心血管有益因子NO的保護，這可能是高脂飲食加重低氧環(huán)境大鼠心肌NO損傷的原因。既往研究也證實血脂異常引起抗氧化能力降低，引起內皮損傷，導致心血管疾病[19]；內源性產生或外源性補充SOD可降低內皮氧化應激損傷，改善血管內皮功能及心肌結構[20,21]。

低氧聯合高脂飲食組大鼠心肌NO降低的同時，心率明顯降低，與既往研究結果一致，即內源性NO含量與心率呈正相關[22]。本研究中，低氧聯合高脂飲食組大鼠血壓與其他兩組比較無明顯變化，心率的降低可能引起該組大鼠心肌灌注減少，加重心肌缺氧。

綜上所述，本研究結果顯示相對于單純低氧，聯合高脂飲食大鼠抗氧化能力降低，心肌NOx損傷加重，提示長期高脂飲食可能是慢性重度低氧環(huán)境下心肌損傷加重的獨立危險因素，抗氧化能力降低可能是其主要原因，應積極干預和治療。在本研究中由于NO半衰期短和實驗條件限制，采用目前常用的研究方法，即測定NOx間接反映NO含量，但NOx不能區(qū)分被過氧化物清除的NO（硝酸鹽與亞硝酸鹽）與有生物活性的NO；另外，大鼠與人體之間存在一定差異，所以本研究結果不能完全反映慢性重度低氧聯合高脂飲食對人心肌的影響，這些不足之處有待在進一步的研究中完善解決。

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Effect of Combined Hypoxia and High Fat Diet on eNOS/NO of Myocardium in Experimental Rats

ZHAO Yan-xia, LI Yu-hong, WANG Ya-ping, YANG Ying-zhong, MA Lan, GE Ri-li.
Medical College of Qinghai University, Xining (810001), Qinghai, China

GE Ri-li, Email: geriligao@hotmail.com

Objective: To investigate the effect of combined hypoxia and high fat diet (HFD) on endothelial nitric oxide synthase (eNOS)/nitric oxide (NO) of myocardium in experimental rats with its possible mechanisms.Methods: A total of 60 male SD rats were randomly divided into 3 groups, n=20 in each group. Control group, the rats were fed by normal diet with normal oxygen condition. Hypoxia group, the rats were fed by normal diet with simulated 5000m altitude oxygen condition. Combined hypoxia and HFD (H+HFD) group, the rats were fed by HFD and simulated 5000m altitude oxygen condition. All animals were treated for 4 weeks and peripheral blood and myocardium specimen were collected. Hemoglobin was examined by automatic blood cell analyzer, plasma malondialdehyde (MDA) was measured by TBA method, superoxide dismutase (SOD) activity was detected by WST-1 method, mRNA and protein expressions of eNOS were examined by real time PCR and Western blot analysis respectively, the myocardium nitrates and nitrites (NOx) was measured by nitrate reductase method.Results: Compared with Control group, Hypoxia group and H+HFD group had increased mRNA and protein expressions of eNOS, H+HFD group had lower NOx levels than the other 2 groups P＜0.05. Compared with Hypoxia group, H+HFD group showed obviously increased total cholesterol, LDL-cholesterol and decreased SOD activity, diseased MDA level P＜0.05.Conclusion: Upon hypoxia alone, H+HFD may further reduce NOx level of myocardium, it implies aggravated chronichypoxia impairment, which might be related to dyslipidemia and lack of anti-oxidative ability in experimental rats.

Hypoxia; High fat diet; Endothelial nitric oxide synthase; Nitric oxide

2014-03-28）

（助理編輯：許菁）

國家自然科學基金資助項目（31160219）；國家國際合作項目（2011DFA32720）；國家973 計劃項目（2012CB518200)

810001 青海省西寧市 青海大學醫(yī)學院

趙艷霞 講師 碩士 主要從事心血管病基礎研究 Email: zhaoyanxia--03@163.com 通訊作者：格日力 Email: geriligao@hotmail.com

R363.16

A

1000-3614（2014）09-0723-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.09.017

方法：雄性SD大鼠60只隨機分為三組，常氧組（南京，海拔10米）、低氧組（低壓氧艙，模擬海拔5000米）、低氧聯合高脂飲食組（低壓氧艙，模擬海拔5000米），經普通飲食或高脂飲食4周后，留取外周血和心肌標本，用全自動血細胞分析儀檢測靜脈血血紅蛋白濃度，TBA比色法檢測血漿丙二醛含量，WST-1法檢測超氧化物歧化酶活力，直接檢測法和終點法檢測血脂含量，熒光實時定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測心肌eNOS mRNA水平，蛋白印跡（Western blot）法檢測心肌eNOS 蛋白水平，硝酸還原酶法檢測心肌NO代謝產物硝酸鹽/亞硝酸鹽（NOX）水平。

結果：低氧組及低氧聯合高脂飲食組心肌eNOS mRNA及蛋白水平明顯高于常氧組（P＜0.05），低氧聯合高脂飲食組心肌NOx水平明顯低于其他兩組（P＜0.05）；與低氧組比較，低氧聯合高脂飲食組血漿總膽固醇及低密度脂蛋白水平明顯升高（P＜0.05），血漿超氧化物歧化酶活力及丙二醛含量明顯降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。

結論：相對于單純低氧，聯合高脂飲食進一步降低大鼠心肌NOx水平，提示高脂飲食加重慢性重度低氧對心肌的損傷，其機制可能與血脂異常及抗氧化能力不足有關。