魏子寒，王穎，楊國杰，孫麗娜

磷酸肌酸鈉對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及機(jī)制研究

魏子寒，王穎，楊國杰，孫麗娜

目的：觀察磷酸肌酸鈉對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞(CF)增殖和膠原合成的影響，并初步探索磷酸肌酸鈉抗心肌纖維化的作用機(jī)制。

磷酸肌酸鈉；心??；成纖維細(xì)胞；磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:738.)

心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF)是多種心臟疾病發(fā)展至終末期的共同病理改變，是心室重塑的重要表現(xiàn)[1,2]。有研究顯示[3]，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖，膠原合成，介導(dǎo)心肌纖維化的形成。

以往的研究顯示[4,5],磷酸肌酸鈉具有保護(hù)心肌、改善心功能的作用，廣泛應(yīng)用于冠心病、心力衰竭等疾病的治療，但其對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CF）增殖及膠原合成的影響如何，其機(jī)制如何，目前并不十分清楚。

為此，本研究采用AngⅡ建立乳鼠心肌纖維化模型，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布、VG染色檢測(cè)心肌間質(zhì)膠原合成及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)心肌組織中磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphated extracellular signal regulated kinase 1/2,pERK1/2)蛋白表達(dá)等方法，探討磷酸肌酸鈉對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖及膠原合成的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

動(dòng)物與主要試劑 ：清潔級(jí)新生Wistar乳鼠（1天）2012-07由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（編號(hào)：TJLA-2003-168）[許可證：SCXX（豫）2010-0002.合格證:0008508]; 新生胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基為美國HyClone公司產(chǎn)品（產(chǎn)地：北京）、AngⅡ、碘化丙啶（PI）、核糖核酸（RNA）酶均購自美國Sigma公司（產(chǎn)地：美國）；胰蛋白酶購自美國Difco公司（產(chǎn)地：北京）；Ⅱ型膠原酶購自美國Invitrogen公司（產(chǎn)地：美國）；TritonTriton X-100購自美國Amresco公司（產(chǎn)地：美國）；磷酸肌酸鈉0.5 g/支為吉林英聯(lián)生物制藥股份有限公司生產(chǎn)；免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒、對(duì)氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物顯色試劑盒、小鼠抗波形蛋白單克隆抗體（mAb）均購自北京中杉金橋公司；小鼠抗 p-ERK1/2 mAbAnti- p-ERK1/2 Mouse Monoclonal Antibody購自美國Cell Signaling公司（產(chǎn)地：美國）。其余產(chǎn)品均為市售分析純。

心肌成纖維細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)：取Wistar乳鼠20只 ，在無菌條件下開胸取出心臟，取左心室，將其剪成1 mm3大小的碎塊，反復(fù)沖洗，加入0.08%胰蛋白酶、0.01%Ⅱ型膠原酶消化10分鐘，反復(fù)多次，直至組織塊消失,分別收集每次消化懸液,離心棄上清,加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，采用差速貼壁2小時(shí)，棄上清，獲得心肌成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞長滿瓶壁后用0.25%胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)采用2～3代的成纖維細(xì)胞。

心肌成纖維細(xì)胞鑒定：CF爬片培養(yǎng)，至細(xì)胞連接成片后，傾去培養(yǎng)基。取出玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS 0.01 mol， pH 7.3，成分: Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl）沖洗，4%多聚甲醛室溫固定,3%H2O2孵育，正常山羊血清封閉，滴加鼠抗波形蛋白抗體工作液（1:50），室溫孵育3小時(shí)，滴加生物素化二抗工作液(北京中杉金橋) 生物素標(biāo)記山羊抗小鼠白免疫球蛋G（IgG），室溫孵育，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑顯色,自來水充分沖洗。蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。于倒置顯微鏡下觀察心肌成纖維細(xì)胞呈梭形，胞體較大，細(xì)胞漿透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，無自發(fā)性搏動(dòng)，通常含2～3個(gè)核。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，細(xì)胞純度達(dá)98%。圖1

分組及處理：取原代乳鼠CF進(jìn)行培養(yǎng)后，無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，根據(jù)加入條件培養(yǎng)基不同分組（每組n=3）: AngⅡ組：含AngⅡ1×10-6mol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液；磷酸肌酸鈉組：含磷酸肌酸鈉10 mmol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液； AngⅡ+磷酸肌酸鈉組：含磷酸肌酸鈉10 mmol/L加AngⅡ10-6mol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液；對(duì)照組：無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)CF。

圖1 心肌成纖維細(xì)胞鑒定圖

流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布[6]：取各處理組處理24 h的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，測(cè)定細(xì)胞不同周期（G0/G1期、S期、G2/M期）。以70%酒精固定細(xì)胞，上機(jī)前加入500 μl碘化丙啶綜合染液（碘化丙啶5 mg,RNA 2 g，1% Triton 0.25 ml，生理鹽水65 ml，加蒸餾水至100 ml，PH 7.2～7.6），室溫染色30分鐘后上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)3次。

VG染色觀察膠原合成[7]：CF爬片培養(yǎng)，待細(xì)胞相互連接成片時(shí)，根據(jù)上述分組處理細(xì)胞24小時(shí)。傾去培養(yǎng)基，沖洗，經(jīng)蘇木素染色，沖洗。滴加VG工作液(1%酸性品紅水溶液10 ml，苦味酸飽和水溶液90 m1)染色。分化、脫水、透明、封片。常規(guī)封片后，切片裝在OlympusCK2型顯微鏡下觀察并攝片，使用Biosins Digital Imaging Systems測(cè)量心肌間質(zhì)膠原含量（積分光密度值）。

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞中pERK1/2蛋白表達(dá)：CF爬片培養(yǎng)，待細(xì)胞連接成片后，各處理因素孵育細(xì)胞30分鐘，傾去培養(yǎng)基。取出玻片， PBS沖洗，4%多聚甲醛室溫固定，3%H2O2孵育，正常山羊血清封閉，滴加pERK1/2抗體工作液比例(1:200)，室溫孵育3小時(shí)，滴加生物素化二抗工作液生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG工作液，室溫孵育15分鐘，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育10分鐘。DAB顯色劑顯色,充分沖洗。蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。切片裝在OlympusCK2型顯微鏡下觀察并攝片，采用Biosins Digital Imaging Systems軟件分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14組心肌成纖維細(xì)胞周期情況

與對(duì)照組相比，AngⅡ組中CF的S期細(xì)胞百分率明顯增加， G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 )。磷酸肌酸鈉組對(duì)CF細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+磷酸肌酸鈉組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分率升高，S期百分率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。詳見表1

表1 四組心肌成纖維細(xì)胞周期情況（n=3，

表1 四組心肌成纖維細(xì)胞周期情況（n=3，

注：與對(duì)照組比較*P＜0.01；與AngII組比較△P＜0.01。AngⅡ：血管緊張素Ⅱ

組別 G0/G1期（%） S期（%） G2/M期（%）對(duì)照組 69.59±1.76 15.14±1.14 15.25±1.25 AngII組 57.98±2.13* 32.57±4.66* 9.44±3.16*磷酸肌酸鈉組 62.78±3.46 21.48±2.76 15.73±1.37 AngII+磷酸肌酸鈉組 68.38±0.46△ 15.31±0.67△ 16.32±0.21△

2.24組膠原含量及pERK1/2蛋白表達(dá)積分光密度值情況

與對(duì)照組相比，AngⅡ組膠原含量增加，pERK1/2蛋白表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01 )。與對(duì)照組比較，磷酸肌酸鈉組膠原含量和pERK1/2蛋白表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05)。與對(duì)照組比較，AngⅡ+磷酸肌酸鈉組pERK1/2蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 )，膠原含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+磷酸肌酸鈉組膠原含量減少，pERK1/2蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01)。表2，圖2、3

表2 四組膠原含量及pERK1/2蛋白表達(dá)積分光密度值情況（n=3，

表2 四組膠原含量及pERK1/2蛋白表達(dá)積分光密度值情況（n=3，

注：與對(duì)照組比較*P＜0.01；與AngII組比較△P＜0.01。pERK1/2:磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶。縮略語余注見表1

組別 膠原含量 PERK1/2表達(dá)對(duì)照組 120.68±4.43 115.12±7.25 AngII組 150.74±3.68* 130.53±10.15*磷酸肌酸鈉組 119.32±2.76 113.43±5.83 AngII+磷酸肌酸鈉組 117.71±2.61△ 120.79±4.27*△

圖2 四組VG染色法膠原合成圖片（×200）

圖3 四組免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（pERK1/2）蛋白圖片（×200）

3 討論

CF是一類具有分裂潛力的細(xì)胞，病理?xiàng)l件下，CF在各種促纖維化的細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)的作用下，通過多種信號(hào)通路的介導(dǎo)，引起CF的過度增殖，最終導(dǎo)致心臟間質(zhì)膠原沉積、心室僵硬度增加，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生,進(jìn)一步導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低，心臟舒縮及電傳導(dǎo)功能障礙[1,2,8,9]。因此，有效抑制病理狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞的過度增殖是心肌保護(hù)的重要一環(huán)。

有研究顯示[10,11]，AngⅡ通過與血管緊張素Ⅱ受體（AT1R）結(jié)合，可增加其細(xì)胞內(nèi)底物的酪氨酸殘基磷酸化，通過酪氨酸激酶途徑活化絲裂素活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)CF的增殖及表型轉(zhuǎn)化，是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RASS）的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在高血壓、心肌梗死、心力衰竭過程中的心肌重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。本研究結(jié)果顯示, AngⅡ組的心肌成纖維細(xì)胞S期的百分率、心肌間質(zhì)膠原含量均較對(duì)照組明顯增加,證實(shí)AngⅡ可以促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖，膠原合成增加。這與以往國內(nèi)外的研究結(jié)果相符[13,14]，進(jìn)一步證實(shí)了AngⅡ具有促進(jìn)膠原的沉積，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)而誘導(dǎo)心肌纖維化的作用。

絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）是連接細(xì)胞外受體和細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的重要信號(hào)調(diào)節(jié)酶，是細(xì)胞內(nèi)眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)和共同通道[15]。已經(jīng)證實(shí)[16]，MAPK信號(hào)通路的過度激活與細(xì)胞的生長、增殖、分化關(guān)系密切。胞外信號(hào)調(diào)控激酶(ERK)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)現(xiàn)3種不同的MAPK之一。ERK通過相鄰的絲氨酸／蘇氨酸和酪氨酸殘基的雙磷酸化而激活。研究證實(shí)[17,18]，ERK1/2通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生、凋亡等過程，在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。pERK1/2是ERK的活化形式，本研究發(fā)現(xiàn)，pERK1/2在AngⅡ誘導(dǎo)的CF中表達(dá)上調(diào)，這一結(jié)果證實(shí)了ERK1/2通路在AngⅡ誘導(dǎo)CF增殖及心肌間質(zhì)膠原合成增多中起到重要作用。

磷酸肌酸鈉是體內(nèi)一種重要的高能化合物,在骨骼肌、心肌、大腦等高耗能組織中含量較高,主要功能是作為線粒體能量轉(zhuǎn)運(yùn)的載體并為三磷酸腺苷（ATP）補(bǔ)充能量維持體內(nèi)ATP濃度的恒定，是人體重要的能量供應(yīng)源。磷酸肌酸分子已被證實(shí)能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,而且它在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)比ATP和二磷酸腺苷都大,這就為由于細(xì)胞膜破損所導(dǎo)致的不正常能量代謝反應(yīng)“鏈”重新運(yùn)作起來創(chuàng)造了條件[19,20]。當(dāng)心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，補(bǔ)充足夠的磷酸肌酸鈉后，在肌酸激酶（CPK）及其同工酶的作用下，磷酸肌酸鈉可將二磷酸腺苷（ADP）轉(zhuǎn)化為ATP，保證Na+-K+-ATP離子泵和Ca2+泵的能量供應(yīng)，為肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白絲的滑行提供能量，恢復(fù)心肌收縮力，改善心肌收縮功能。本研究結(jié)果顯示，磷酸肌酸鈉組單獨(dú)作用時(shí)，與對(duì)照組比較CF的分布周期比例及膠原的合成無明顯增多，提示無外源性因素刺激時(shí)磷酸肌酸鈉不干擾CF的生長。在AngⅡ（1×10-6mol/L）過度刺激的條件下，磷酸肌酸鈉能夠部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CF的增殖及膠原合成。并且該作用是通過部分抑制ERK激活引發(fā)的。目前國內(nèi)外尚未有關(guān)于磷酸肌酸鈉相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究，但有研究發(fā)現(xiàn)[21]， ATP呈時(shí)間依賴性激活前列腺癌細(xì)胞中ERK1/2信號(hào)通路，從而影響腫瘤細(xì)胞的脫氧核糖核酸（DNA）合成。因此我們推測(cè)磷酸肌酸鈉通過轉(zhuǎn)化成ATP，繼而干擾ERK通路信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CF細(xì)胞周期分布及膠原合成。在今后的工作中，我們將使用ERK阻斷劑及ATP阻斷劑進(jìn)行干預(yù)，對(duì)磷酸肌酸鈉的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步探討了磷酸肌酸鈉對(duì)心肌纖維化的防治作用及其機(jī)制，證實(shí)磷酸肌酸鈉通過作用于ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)的pERK1/2蛋白表達(dá)，抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖，降低膠原合成，從而改善心肌纖維化的發(fā)生。磷酸肌酸鈉還可作為防治心肌纖維化的藥物，本研究為磷酸肌酸鈉的臨床應(yīng)用提供了新的領(lǐng)域。

[1] Porter KE, Turner NA. Cardiac fibroblasts: At the heart of myocardial remodeling. Pharmacol Ther，2009，123：255-278.

[2] 楊四寶，高永建，楊萍. 轉(zhuǎn)化生長因子β與microRNAs的串話效應(yīng)在心肌纖維化中的研究進(jìn)展. 中國循環(huán)雜志，2013, 28：552-554.

[3] Wang LP, Wang Y. Angiotensin Ⅱ upregulates KCa3. 1 channels and stimulates cell proliferation in rat cardiac fibroblasts. Biochemical Pharmacology，2013，85: 1486.

[4] Fragasso G, Perseghin G, De Cobelli F, et al. Effects of metabolic modulation by trimetazidine on left ventricular function and phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio in patients with heart failure. Eur Heart J, 2006, 27: 942-948.

[5] Feng NC, Satoh H, Urushida T, et al. A selective inhibitor of Na+/ Ca2+ exchanger, SEA0400, preserves cardiac function and highenergy phosphates against ischemia/reperfusion injury. Cardiovasc Pharmacol， 2006，47: 263-270.

[6] 崔巍, 李玉琳, 吳依娜. 高內(nèi)涵篩選與流式細(xì)胞分析技術(shù)在心肌成纖維細(xì)胞增殖研究中的應(yīng)用. 生理學(xué)報(bào)，2014，66：215-222.

[7] Sun L，Zheng Z. Effect of Salvia Miltiorrhiza Bge on Left Ventricular Hypertrophy and the Expression of Tumor Necrosis Factor-α in Spontaneously Hypertensive Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology, 2007，27: 245-247.

[8] Stein M, Noorman M, van Veen TA, et al. Dominant arrhythmia Vulnerability of the right ventricle in senescent mice. Heart Rhythm, 2008, 5: 438-448.

[9] Zannad F, Radauceanu A. Effect of mr blockade on collagen formation and cardiovascular disease with a specific emphasis on heart failure. Heart Fail Rev, 2005, 10: 71-78.

[10] Mehta PK, Griendling KK. Angiotensin Ⅱ cell signaling: physiological and pathological effects in the cardiovascular system. Physiol Cell Physiol，2007，292: C82-97.

[11] 唐兵，何國詳，李德，等. 血管緊張素II2型受體介導(dǎo)抑制大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生的機(jī)制. 中國循環(huán)雜志，2006, 21：148-151.

[12] Stein M, Boulaksil M, Jansen JA, et al. Reduction of fibrosis-related arrhythmias by chronic renin-angiotensin-aldosterone system inhibitors in an aged mouse model. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 299: H310-321.

[13] Zhang W, Chen XF, Huang YJ, et al. 2, 3, 4, 5-Tetrahydroxystilbene-2-O-b-d-glucoside inhibits angiotensin Ⅱ -induced cardiac fibroblast proliferation via suppression of the reactive oxygen species-extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39: 429.

[14] Olson ER, Shamhart PE, Naugle JE, et al. Angiotensin Ⅱ -induced extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation is mediated by protein kinase C delta and intracellular calcium in adult rat cardiac fibroblasts. Hypertension，2008，51: 704.

[15] Morley JE, Kaiser FE, Perry HM, et al. Longitudinal changes in testosterone, luteinizing hormone, and follicle-stimulating hormone in healthy older men. Metabolism1，1997，46: 410.

[16] Schilling M, Maiwald T, Hengl S, et al. Theoretical and experimental analysis links isoform- specific ERK1/2 signalling to cell fate decisions. Mol Syst Biol， 2009，5: 334.

[17] Yeh CC, Li HZ, Malhotra D, et al. Distinctive ERK1/2 and p38 Signaling in Remote and Infarcted Myocardium During Post-MI Remodeling in the Mouse. Cell Biochem，2010， 109: 1185-1191.

[18] Zhang J, Bian HJ, Li XX, et al. ERK1/2-MAPK Signaling Opposes Rho-Kinase to Reduce Cardiomyocyte Apoptosis in Heart Ischemic Preconditioning. Mol Med，2010， 16: 307-315.

[19] Nakae I，Mitsunami K，Omura T，et a1． Proton magnetic resonance spectroscopy can detect creatine depletion asso-ciated with the progression of heart failure in cardiomyopa-thy． Am Coll Cardiol，2003，42: 1587-1593．

[20] 郭曉綱，呂新圓，程衛(wèi)平，等. 磷酸肌酸對(duì)體外循環(huán)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者心肌保護(hù)和血流動(dòng)力學(xué)的影響. 中國循環(huán)雜志，2006, 21：461-464.

[21] 賀慧穎，方偉崗，鄭杰，等. 絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶5調(diào)節(jié)人前列腺癌細(xì)胞生長及侵襲的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，20：1812-1817.

Effect of Phosphocreatine on Angiotensin II Induced Proliferation and Collagen Synthesis of Cardiac Fibroblasts in Neonatal Rats With its Mechanism

WEI Zi-han, WANG Ying, YANG Guo-jie, Sun Li-na.
Department of Geriatrics Cardiology, First Aff i liated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450052), Henan, China

WANG Ying, Email: 2414714561@qq.com

Objective: To investigate the effect of phosphocreatine (PCr) on angiotensin II (Ang II) induced proliferation and collagen synthesis of cardiac fi broblasts in neonatal rats with its mechanism.Methods: The cardiac fi broblasts (CF) from neonatal rats were cultured in vitro and were divided into 4 groups.①Control group, the CF was cultured in non-serum DMEM, ②Ang II group, the CF was cultured with Ang II at (1×10-6) mol/L, ③PCr treated group, the CF was cultured with PCr at 10 mmol/L, and ④Ang II + PCr group. The CF cell cycle percentage was detected by fl ow cytometric assay, myocardial collagen content was observed by VG staining and protein expression of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (pERK1/2) was detected by immuneohistochemistry.Results: ① Compared with Control group, the CF in Ang II group showed increased percentage of S phase and decreased percentage of G0/G1and G2/M phases, increased collagen content and pERK1/2 protein expression, all P＜0.01.② The CF cell cycle, collagen content and pERK1/2 protein expression were similar between Control group and PCr treated group, all P＞0.05. ③ Compared with Control group, Ang II + PCr group had elevated pERK1/2 protein expression, P＜0.01, while the CF cell cycle and collagen content were similar with Control group, P＞0.05. ④Compared with Ang II group, the CF in Ang II + PCr group had increased percentage of G0/G1and G2/M phases, decreased percentage of S phase, decreased collagen content and pERK1/2 protein expression, all P＜0.01.Conclusion: PCr may partially inhibit Ang II induced CF proliferation and collagen synthesis which might be related to the inhibition of excessively activated ERK1/2. Therefore, PCr could improve Ang II induced myocardial fi brosis in neonatal rats.

Phosphocreatine; Myocardium; Fibroblasts; Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase

2014-04-21）

（編輯：王寶茹）

450052 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年心血管科

魏子寒 主治醫(yī)師 碩士 主要從事心血管內(nèi)科的臨床及科研工作 Email: weizihan1985@163.com 通訊作者：王穎 Email: 2414714561@qq.com

R54

A

1000-3614（2014）09-0738-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.09.020

方法：將20只Wistar乳鼠取出心臟，體外原代、傳代培養(yǎng)CF。實(shí)驗(yàn)分4組（每組n=3），對(duì)照組：無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)CF； AngⅡ組：含 AngⅡ 1×10-6mol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液；磷酸肌酸鈉組：含磷酸肌酸鈉10 mmol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液；AngⅡ+磷酸肌酸鈉組：含磷酸肌酸鈉10 mmol/L 加AngⅡ 1×10-6mol/L的無血清DMEM培養(yǎng)液。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布，Van Gieson（VG）氏染色法測(cè)定膠原含量，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（pERK1/2）蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果：與對(duì)照組相比，AngⅡ組CF的S期細(xì)胞百分率明顯增加， G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分率降低，膠原含量增加，pERK1/2蛋白表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01 )。與對(duì)照組比較，磷酸肌酸鈉組CF細(xì)胞周期、膠原含量和pERK1/2蛋白表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05)。與對(duì)照組比較，AngⅡ+磷酸肌酸鈉組pERK1/2蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 )，CF細(xì)胞周期和膠原含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+磷酸肌酸鈉組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞百分率升高，S期百分率降低，膠原含量減少，pERK1/2蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01)。

結(jié)論：磷酸肌酸鈉可部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖和膠原合成增加，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2過度激活有關(guān)。這提示磷酸肌酸鈉可以明顯改善AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化。