史彤彤，程明月，張超群，張卓琦，王志榮

白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及其可能機(jī)制

史彤彤，程明月，張超群，張卓琦，王志榮

目的：探究白藜三醇（Res） 對正常狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC） 血管生成的影響及其可能機(jī)制。

白藜三醇；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；血管生成

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:643.)

冠心病在我國的發(fā)病率、致殘率及死亡率日趨增高，嚴(yán)重危害了人類的健康。冠狀動脈（冠脈）狹窄或閉塞會導(dǎo)致心肌缺血、壞死，當(dāng)心肌發(fā)生缺血、壞死時，機(jī)體可代償性的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，從而促進(jìn)梗死周圍區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立，但這種代償不足以滿足機(jī)體改善心肌供血的需要，因而 “治療性血管新生”的概念應(yīng)運(yùn)而生[1]。治療性血管新生，即缺血區(qū)的“自我血管搭橋”，是通過人為因素，包括藥物治療、干細(xì)胞移植、基因轉(zhuǎn)染等來促進(jìn)缺血區(qū)血管新生，從而改善缺血組織的血液供應(yīng)，已經(jīng)成為近年來心血管疾病治療研究的熱點(diǎn)。白藜三醇存在于葡萄皮、花生及中藥虎杖等植物中的一種非黃酮類多酚化合物，已被證實具有心血管保護(hù)作用，包括延緩動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等[2-4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，白藜三醇能夠有效促進(jìn)豬急性閉塞冠脈側(cè)枝循環(huán)的建立[5]，本實驗將從細(xì)胞水平探討白藜三醇對血管生成的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

藥品及試劑：白藜三醇、NG-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME，一氧化氮合酶阻斷劑）購于美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。兔抗人蛋白激酶B（Akt）多克隆抗體、兔抗人磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）多克隆抗體和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）阻斷劑（ LY294002）購于美國Cell Signaling Technology公司。兔抗人eNOS多克隆抗體、transwell chamber、Matrigel（GFR）購于美國BD biosciences公司。結(jié)晶紫染液、CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗人磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（p-eNOS） 購于美國Abcam公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠和山羊抗兔IgG均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NO檢測試劑盒購于南京建成生物公司。

細(xì)胞來源：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。

細(xì)胞培養(yǎng)：取HUVEC細(xì)胞株，復(fù)蘇后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法按1:3分瓶傳代。

實驗分組：分為DMEM高糖（＜4 500 mg/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)組（正常組）、白藜三醇組（藥物組）、白藜三醇+LY294002組（藥物阻斷劑組1）、LY294002組（阻斷劑組1）、白藜三醇+L-NAME組（藥物阻斷劑組2）、L-NAME組（阻斷劑組2）。

CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[6]，以1×104/ml的密度接種于96孔板，分組處理細(xì)胞，每組均設(shè)5個平行孔。孵育24 h后加入CCK-8，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于490 nm檢測每孔光密度值（D） 值。細(xì)胞增殖率=（D藥物組-D正常組）/D藥物組×100%。

免疫印跡（Westem blot）法檢測Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白的表達(dá)：分組處理后細(xì)胞用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（含有NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）清洗干凈，使用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解5 min，13 000 g離心15 min（4℃），收集上清，參照文獻(xiàn)[7]按照二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%濃縮膠和10%分離膠跑膠，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜，含5%脫脂牛奶的緩沖液（含有Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=7.4）封閉3 h，一抗4℃孵育過夜，緩沖液洗3遍，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，緩沖液洗3遍，每次10 min，顯色，掃描。

硝酸還原酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮（NO）的濃度：參照文獻(xiàn)[8]，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×105/ml的密度接種于24孔板，分組處理細(xì)胞，每組均設(shè)3個平行孔，收集每孔細(xì)胞培養(yǎng)液待檢測。按照試劑盒說明書分步處理，最終各取上清液移至96孔板，用酶標(biāo)儀于550 nm檢測每孔光密度（D）值，其計算公式如下：NO含量（μmol/L）=（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度） ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度100 μmol/L。

內(nèi)皮細(xì)胞體外遷移實驗：參照文獻(xiàn)[9]，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后用含0.5%胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于上室加入100 μl細(xì)胞懸液（1×105/孔），下室加入700 μl去血清培養(yǎng)基 ，按照分組處理細(xì)胞后，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)10 h后，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，下膜用結(jié)晶紫染色，中性樹脂封片后顯微鏡下計數(shù)（隨機(jī)取5個視野）。

內(nèi)皮細(xì)胞的體外小管形成實驗：參照文獻(xiàn)[10]，將基質(zhì)膠以每孔60 μl鋪于96孔板中（按實驗分組，每組均設(shè) 3個平行孔），將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中放置1 h。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并以1×104/孔種在基質(zhì)膠上，按分組處理細(xì)胞后，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，18 h后鏡下觀察并分析（隨機(jī)取5個視野）, 應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野小管數(shù)量，結(jié)果以與正常組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的影響

藥物組（1、5 μmol/L）與正常組相比細(xì)胞增殖增加（P＜0.01）；藥物組0.2、10、20 μmol/L與藥物組5 μmol/L相比細(xì)胞增殖降低（P＜0.01） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。余實驗選取5 μmol/L白藜三醇。

2.2 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B、磷酸化蛋白激酶B、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白及細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)一氧化氮水平表達(dá)的影響

5 μmol/L的白藜三醇作用于細(xì)胞， p-Akt 在白藜三醇作用10、15、20、30 min后與正常組相比表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05～0.01），p-eNOS、NO在白藜三醇作用15、20 min后與正常組相比表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05～0.01；表2、圖1）。LY294002（10 μmol/L）預(yù)孵育細(xì)胞1 h后再加入白藜三醇（5 μmol/L）作用10 min，結(jié)果表明：藥物組比正常組p-Akt增高（P＜0.01）、p-eNOS（P＜0.05）蛋白及NO水平增加（P＜0.05）；藥物阻斷劑組1較藥物組p-AkT增高（P＜0.01）、p-eNOS 蛋白及NO水平減低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05～0.01）。表3、圖1

表1 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增值的影響

表1 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增值的影響

注：與正常組相比**P＜0.01；與藥物組5μ mol/L濃度相比 △△P＜0.01

組別 D值正常組 0.918±0.094藥物組0.2μ mol/L 0.942±0.054△△1μ mol/L 1.134±0.105**5μ mol/L 1.179±0.089**10μ mol/L 0.958±0.064△△20μ mol/L 0.746±0.092△△

表2 白藜三醇作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時間對藥物組p-Akt、p-eNOS及NO水平的影響

表2 白藜三醇作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時間對藥物組p-Akt、p-eNOS及NO水平的影響

注：與正常組相比*P＜0.05 **P＜0.01。p-Akt：磷酸化蛋白激酶B p-eNOS：酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶 NO：一氧化氮

組別 p-Akt p-eNOS NO(μ mol/L)正常組 1.000±0.000 1.000±0.000 14.38±0.538藥物組5 min 1.074±0.054 1.054±0.068 15.08±0.659 10 min 1.311±0.063** 1.079±0.075 15.53±0.527 15 min 1.247±0.100* 1.184±0.087* 16.79±0.639**20 min 1.244±0.086* 1.202±0.103* 17.06±0.794**30 min 1.234±0.095* 1.058±0.086 15.45±0.654

2.3 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響

藥 物 組（5 μmol/L） 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 遷 移 率（138.20±7.413）%大于正常組（100.00±0.000）%（P＜0.01），藥物阻斷劑組2加入L-NAME（3 mmol/L）后內(nèi)皮細(xì)胞遷移率（88.29±5.364）%小于藥物組（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。阻斷劑組2內(nèi)皮細(xì)胞遷移率（86.25±7.469）%與藥物阻斷劑組2相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖2

表3 各組藥物作用10分鐘后磷酸化蛋白激酶B、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白、一氧化氮水平水平比較

表3 各組藥物作用10分鐘后磷酸化蛋白激酶B、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白、一氧化氮水平水平比較

注：與正常組比*P＜0.05 **P＜0.01；與藥物組比△P＜0.05 △△P＜0.01。余注見表2

組別 p-Akt p-eNOS NO(μ mol/L)正常組 1.000±0.000 1.000±0.000 14.61±0.855藥物組 1.441±0.061** 1.148±0.062* 16.96±0.929*藥物阻斷劑組1 0.957±0.102△△ 0.907±0.051△△13.42±0.603△阻斷劑組 1 1.012±0.090 0.856±0.074 13.69±0.433

圖1 免疫印跡法分析各組細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)（各組蛋白條帶n=3）

圖2 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響(×400)

2.4 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外小管形成的影響

藥物組（5 μmol/L）體外小管形成數(shù)量（145.20±13.441）%大于正常組（100.00±0.000）%（P＜0.01），藥物阻斷劑組2加入L-NAME（3 mmol/L）后內(nèi)皮細(xì)胞體外小管形成數(shù)量（81.39±12.815）%小于藥物組（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。阻斷劑組2內(nèi)皮細(xì)胞體外小管形成數(shù)量（67.59±15.307）%與藥物阻斷劑組2相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖3

圖3 白藜三醇對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外血管形成的影響（×200）

3 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，白藜三醇通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的表達(dá)來發(fā)揮血管生成誘導(dǎo)作用，其機(jī)制可能是通過PI3K/Akt/eNOS信號通路的激活。

血管生成是從先前存在的脈管系統(tǒng)萌發(fā)出新的毛細(xì)血管的過程，對于許多病理及生理過程都是必須的[11]。在血管生成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及形成管腔樣結(jié)構(gòu)，而這一系列的事件都是由細(xì)胞因子調(diào)控，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、NO等，其中NO是由eNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生的氣體信號分子，主要通過促進(jìn)血管舒張、抑制血小板聚集和白細(xì)胞粘附來調(diào)節(jié)心血管功能[12]。有研究表明，在eNOS-deficient的小鼠上建立肢體缺血模型后，對于缺血組織的血管新生應(yīng)答被損壞，而且注入重組血管內(nèi)皮生長因子或腺病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)錄并不能逆轉(zhuǎn)上述改變[13]。因此，血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)的血管新生依賴于NO。eNOS的活性調(diào)節(jié)可通過多種方式，包括mRNA和蛋白表達(dá)量的改變、eNOS信號復(fù)合體的形成、細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位和特定氨基酸殘基位點(diǎn)的磷酸化[14]，其中位于eNOS羧基端還原酶區(qū)域的Ser-1177位點(diǎn)磷酸化對eNOS活性增強(qiáng)很關(guān)鍵，其磷酸化水平提高能夠使NO合成增加[15]。本實驗通過檢測白藜三醇作用于HUVEC后Ser-1177位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)白藜三醇能夠提高其磷酸化水平，說明白藜三醇可通過上調(diào)eNOS的酶活性而使HUVEC的NO合成增加。

體外研究中通常通過觀察內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠上的小管形成情況來評價內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。本實驗結(jié)果顯示，一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME能夠抑制白藜三醇對HUVEC體外小管形成的促進(jìn)作用。而在血管生成過程中，細(xì)胞遷移是一個重要環(huán)節(jié)，本實驗通過細(xì)胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)L-NAME同樣抑制了白藜三醇對HUVEC細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。綜上所述，白藜三醇能夠通過上調(diào)NO表達(dá)來促進(jìn)HUVEC體外血管生成。

為進(jìn)一步探究eNOS活性改變的機(jī)制，我們檢測了可能引起這個位點(diǎn)磷酸化改變的上游激酶的變化[16]，即Akt蛋白的表達(dá)。Akt在信號通路中的上游信號分子有PI3K，活化的PI3K可使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上．并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的輔助下，通過使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser473）磷酸化而使其激活，而激活的Akt能夠使下游一系列蛋白活化，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移[17]。本實驗結(jié)果顯示，白藜三醇能夠上調(diào)Akt的Ser-473位點(diǎn)磷酸化水平，這和白藜三醇引起的eNOS的Ser-1177位點(diǎn)磷酸化水平及NO表達(dá)增加相一致，而且加入PI3K阻斷劑LY294002后抑制了Akt、eNOS的活化及NO的生成。所以說，一定濃度的白藜三醇能夠活化PI3K/Akt/eNOS信號通路，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，進(jìn)而對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外小管形成發(fā)揮促進(jìn)作用。

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Effect of Resveratrol on Angiogenesis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells With the Possible Mechanisms

SHI Tong-tong, CHENG Ming-yue, ZHANG Chao-qun, ZHANG Zhuo-qi, WANG Zhi-rong.
Department of Cardiology, The Aff i liated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou ( 221002), Jiangsu, China

WANG Zhi-rong, Email: xzzrw@163. com

Objective: To explore the effect of resveratrol (Res) on angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with the possible mechanisms in vitro.Methods: The HUVECs were cultured in 6 groups.①Control group, HUVEC were cultured with high glucose in DMEM, ②Res group, the cell were cultured with Res at different concentrations, ③Res with PI3K blocker LY294002 (Res+Blocker 1) group, ④Blocker 1 group, HUVEC were cultured with LY294002 alone, ⑤Res with eNOS blocker L-NAME (Res +Blocker 2) group and ⑥Blocker 2 group. The effect of Res on HUVEC proliferation was detected by CCK-8 kit, the protein expressions of p-Akt, p-eNOS were examined by Westin blot analysis, nitric oxide (NO) level was measured by nitrate reduction method and the endothelial cell migration was assayed by transwell chamber method.Results: ① Compared with Control group, HUVEC proliferation increased in Res (1, 5μmol/L ) group, P＜0.01, the proliferation in Res (5μmol/L) group was higher than those in Res (0.2, 10, 20μmol/L) group, P＜0.01, while Res(20 μmol/L) group could inhibit the proliferation P＜0.01. ②Compared with Control group, Res (5μmol/L) group had the higher protein expressions of p-Akt, p-eNOS, P＜0.05-0.01, higher NO level, P＜0.05. ③Compared with Res group, Res+Blocker 1 group had lower expressions of p-Akt, p-eNOS, P＜0.01, lower NO, P＜0.05; the expressions of p-Akt, p-eNOS and NO level were similar between Res+Blocker 1 group and Blocker 1 group, all P＞0.05. ④Compared with Control group, the cell migration and tubing formation were higher in Res (5μmol/L) group, P＜0.01; compared with Res group, the cell migration and tubing formation were lower in Res+Block2 group, P＜0.01.Conclusion: Res could up-regulate NO level via activating PI3-K/Akt/eNOS signaling and therefore, improving the proliferation, migration and tubing formation of HUVEC in vitro.

Resveratrol; p-Akt; p-eNOS; NO; Angiogenesis

2014-02-20）

（編輯：常文靜）

221002 江蘇省徐州市，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

史彤彤 住院醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病的防治研究 Email：447874025@qq.com 通訊作者：王志榮 Email: xzzrw@163.com

R54

A

1000-3614（2014）08-0643-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.08.021

方法：體外培養(yǎng)HUVEC，實驗分為：DMEM高糖（＜4 500 mg/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)組（正常組）、白藜三醇組（藥物組）、白藜三醇+磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）阻斷劑組（LY294002，藥物阻斷劑組1）、LY294002組（阻斷劑組1）、白藜三醇+ NG-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽組（一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME，藥物阻斷劑組2）、L-NAME組（阻斷劑組2），其中LY294002為磷脂酰肌醇3-激酶阻斷劑。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況；免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白的表達(dá)；亞硝酸還原酶法檢測一氧化氮（NO）的水平；遷移小室（transwell chamber）檢測內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力；小管形成實驗檢測內(nèi)皮細(xì)胞的體外小管形成能力。

結(jié)果：①藥物組（1、5 μmol/L）與正常組相比細(xì)胞增殖增加（P＜0.01）；藥物組（5 μmol/L）與藥物組（0.2、10、20 μmol/L）相比細(xì)胞增殖增加（P＜0.01）；藥物組（20 μmol/L）對細(xì)胞增殖有抑制作用（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。②藥物組（5 μmol/L ） 較正常組p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)增加（P＜0.05～0.01），NO水平增加（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；藥物阻斷劑組1 p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)與藥物組比較均減低（P均＜0.01），NO水平減低（P＜0.05）；藥物阻斷劑組1（5 μmol/L）較阻斷劑組1 p-Akt蛋白、p-eNOS蛋白及NO差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）。③細(xì)胞遷移及小管形成實驗：藥物組（5 μmol/L）內(nèi)皮細(xì)胞遷移率及體外小管形成數(shù)量大于正常組（P＜0.01），藥物阻斷劑組2內(nèi)皮細(xì)胞遷移率及體外小管形成數(shù)量小于藥物組（P＜0.01）。

結(jié)論：白藜三醇可能通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路誘導(dǎo)正常狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的增加，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外小管形成。