齊玉明，成艷梅，李 彥，李 研，賈 麗

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌和漿液性癌中的差異表達(dá)

齊玉明，成艷梅，李 彥，李 研，賈 麗

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 檢測(cè)GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌與漿液性癌中的差異表達(dá)，判斷卵巢透明細(xì)胞癌與不良預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接(SP)法和逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌和漿液性囊腺癌中的差異表達(dá)。結(jié)果 GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于卵巢漿液性囊腺癌(P<0.05)；且GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與鉑類耐藥有關(guān)。結(jié)論 GPC-3的過表達(dá)與腫瘤的低分化和以鉑類為基礎(chǔ)的化療耐藥有關(guān)，而且與卵巢透明細(xì)胞癌的不良預(yù)后有關(guān)。

卵巢透明細(xì)胞癌；GPC-3；鉑類耐藥；預(yù)后

卵巢透明細(xì)胞癌是卵巢上皮性腫瘤中的一種，但它的生物學(xué)行為與其他上皮性腫瘤明顯不同。和其他上皮性卵巢癌相比，卵巢透明細(xì)胞癌預(yù)后更差，即使早期發(fā)現(xiàn)，預(yù)后仍然不良。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種基因與卵巢透明細(xì)胞癌不良預(yù)后有關(guān)，但迄今為止，仍未能找到一種有效區(qū)分卵巢透明細(xì)胞癌和大多數(shù)上皮性卵巢癌的標(biāo)志物用于臨床診斷和評(píng)價(jià)該腫瘤。本研究通過定量PCR和免疫組化方法，檢測(cè)GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌和漿液性癌組織的表達(dá)差異，判斷卵巢透明細(xì)胞癌的預(yù)后。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2004年6月—2010年5月我院收治的16例卵巢透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本(I期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期3例，Ⅳ期2例)作為實(shí)驗(yàn)組，患者平均年齡53.2歲。對(duì)照組為同期收治的22例漿液性囊腺癌組織標(biāo)本(Ⅰ期3例，Ⅱ期5例，Ⅲ期14例)，患者平均年齡54.6歲。2組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，標(biāo)本實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)冰凍切片、HE染色、病理檢查證實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 腫瘤切下后,從腫瘤生長(zhǎng)活躍、無壞死的邊緣部位取下約1 cm3大小的組織2塊，一塊放入甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化測(cè)定；另一塊裝入酶滅活的凍存管，迅速投入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2 免疫組化檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)卵巢透明細(xì)胞癌組織與卵巢漿液性囊腺癌組織中GPC-3的表達(dá)：標(biāo)本常規(guī)脫水、包埋并制成4 μm厚的連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法進(jìn)行組化檢測(cè)。兔抗人多克隆HuR抗體為Santa Cruz產(chǎn)品，兔SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。染色步驟按SP試劑盒(北京中杉金橋試劑公司)說明書進(jìn)行，一抗滴度為1∶200。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢透明細(xì)胞癌組織與卵巢漿液性囊腺癌組織中GPC-3 mRNA的表達(dá)，引物及試劑盒由北京賽百盛基因有限公司提供。采用TRIzol一步法提取組織總RNA。反應(yīng)總體積20 μL，RNA模板量1 μg，參照試劑盒說明進(jìn)行。產(chǎn)物長(zhǎng)度及引物序列如下：GPC-3上游引物為5′-CTCCTAGCTCCCTGCGAAG和5′-TCTCCAGTACTTGTCAATCTC，下游引物為5′-GTTACTGCAATGTGGTCATGC和5′-ACATGTGCTGGGCACCAG；β-actin上游引物為5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’，下游引物為5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，33次循環(huán)后72 ℃延伸 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，β-actin作為內(nèi)參照物，紫外透射成像系統(tǒng)顯像，測(cè)定特異條帶的密度并與內(nèi)參照比較，得出目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，等級(jí)資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌和卵巢漿液性囊腺癌的表達(dá) GPC-3在卵巢透明細(xì)胞癌的陽性表達(dá)率為56%(9/16)，而在卵巢漿液性囊腺癌中的陽性表達(dá)率為18%(4/22)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 GPC-3 mRNA在卵巢透明細(xì)胞癌和卵巢漿液性囊腺癌的表達(dá) 16例卵巢透明細(xì)胞癌中10例呈陽性表達(dá)(62%)，22例卵巢漿液性囊腺癌中5例呈陽性表達(dá)(23%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；透明細(xì)胞癌和漿液性囊腺癌組織中GPC-3 mRNA表達(dá)水平分別為0.381±0.036和0.114±0.021，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

卵巢透明細(xì)胞癌是上皮性卵巢癌中較為罕見的病理類型，但卻有不同于其他上皮性卵巢癌的臨床特征和極不良的預(yù)后[1]。由于卵巢透明細(xì)胞癌相對(duì)于其他上皮性卵巢癌更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥，從而導(dǎo)致該腫瘤預(yù)后不良。

GPC-3是一種硫酸肝素類蛋白多糖，由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖三者共價(jià)連接的復(fù)雜糖復(fù)合物，廣泛存在于細(xì)胞表面，通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細(xì)胞膜表面，目前認(rèn)為其HS基與大量生物效應(yīng)分子(包括生長(zhǎng)因子及其受體、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和黏附分子等)相互作用，故而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附和遷移等[2]。其Arg(358)與Ser(359)間分裂可產(chǎn)生可溶性NH2端(sGPC-3)，在原發(fā)性肝癌患者血清中特異性升高[3]。研究發(fā)現(xiàn)GPC-3主要通過Wnts信號(hào)途徑產(chǎn)生作用，而且GPC-3對(duì)于經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑Wnts途徑都有調(diào)節(jié)作用。GPC-3通過自分泌和旁分泌的方式來激活經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑使Wnt基因高表達(dá)，而Wnt基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠促進(jìn)多種腫瘤組織生長(zhǎng)，通過促進(jìn)Wnt與其特異的Frizzled受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的持續(xù)增殖。

近來研究表明，GPC-3在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如肝癌、惡性黑素瘤、卵巢透明細(xì)胞癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤、睪丸癌、脂肪肉瘤等，提示GPC-3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。

腫瘤耐藥方面的研究表明，卵巢透明細(xì)胞癌中GPC-3表達(dá)陽性的鉑類耐藥的發(fā)生率比GPC-3陰性的鉑類耐藥發(fā)生率高[5]。GPC-3中與X相連的SGBS的表達(dá)缺失導(dǎo)致GPC-3在卵巢惡性腫瘤表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖和分化。Shirakawa等[2]研究結(jié)果表明，GPC-3的表達(dá)上調(diào)與肝癌的不良預(yù)后和化療耐藥密切相關(guān)。

卵巢透明細(xì)胞癌相對(duì)于其他上皮性卵巢癌更容易發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移和化療耐藥，這是導(dǎo)致該腫瘤預(yù)后不良的重要因素。因?yàn)槁殉餐该骷?xì)胞癌相對(duì)于其他上皮性癌表現(xiàn)出一種低水平的增殖。高度增殖的細(xì)胞對(duì)化療是敏感的，而低度增殖的細(xì)胞對(duì)于化療是不敏感的，這也就解釋了卵巢透明細(xì)胞癌對(duì)化療耐藥的原因。在小鼠體內(nèi)的研究表明[6]，GPC-3可抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果表明，GPC-3陽性患者是一種低水平的增殖，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥。

GPC-3與卵巢透明細(xì)胞癌預(yù)后不良密切相關(guān)，這些結(jié)果表明GPC-3是一個(gè)可靠的、極有希望的預(yù)后因素，而且可能成為卵巢透明細(xì)胞癌的一個(gè)新的分子治療方案。

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