趙 慧，徐 迪

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510642)

黃曲條跳甲Phyllotreta striolata Fabricius屬鞘翅目葉甲科［1］，主要危害十字花科蔬菜，尤其對(duì)油菜等經(jīng)濟(jì)作物有較嚴(yán)重的危害［2］.目前對(duì)黃曲條跳甲主要采用化學(xué)方法防治，且多以防治成蟲(chóng)為主，葉面噴藥無(wú)法兼顧土中幼蟲(chóng)、蛹和卵，藥劑持效期一過(guò)，成蟲(chóng)不斷羽化出土為害，使得噴藥次數(shù)和藥量增加，害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，加重農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染.

尋找高效、快速、方便、經(jīng)濟(jì)且活性高、毒性小的植物次生物質(zhì)，并通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)上的修飾或模擬等方法獲得的植物化合物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［3-4］.利用植物的次生物質(zhì)來(lái)防治黃曲條跳甲是保護(hù)農(nóng)作物的途徑之一［5］.已有研究表明多種植物次生物質(zhì)對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)具有選擇性和非選擇性拒食作用［6-10］.多項(xiàng)研究顯示鬼臼毒素及其衍生物對(duì)菜粉蝶Pieris rapae、粘蟲(chóng)Mythimna separata等鱗翅類害蟲(chóng)和鞘翅類昆蟲(chóng)均有拒食、毒殺、抑制生長(zhǎng)發(fā)育等作用［11-12］.對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得的衍生物能擴(kuò)大殺蟲(chóng)范圍和提高殺蟲(chóng)活性［13］.筆者研究了鬼臼毒素及其衍生物4'-去甲基鬼臼毒素對(duì)黃曲條跳甲的拒食活性，鬼臼毒素具有抗腫瘤、抗病毒作用，其衍生物能降低藥物副作用［14］，因此將鬼臼毒素及其衍生物用于黃曲條跳甲防治，對(duì)人類健康和環(huán)境沒(méi)有危害，鬼臼毒素及其衍生物有望成為防治黃曲條跳甲的一種新型生物農(nóng)藥.

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器

窩兒七Rhizoma et Radix Diphylleiae Diphylleia sinensis Li購(gòu)自廣州清平中藥市場(chǎng);黃曲條跳甲成蟲(chóng)采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地并無(wú)農(nóng)藥飼養(yǎng)2代;吐溫、石油醚(60-90)、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇等溶劑(均為分析純)為天津化學(xué)試劑一廠生產(chǎn);柱層析硅膠(100～200目)、薄層層析硅膠(H與GF254)為青島海洋化工廠有限公司生產(chǎn);羧甲基纖維素鈉(CMC)為上?；瘜W(xué)試劑分廠生產(chǎn).Varian Unity INOVA500型核磁儀(美國(guó)Varian公司);VGAutospec-500質(zhì)譜儀(美國(guó)Beckman公司);FINNIGAN TRACE GC-MSTM，TR201818(美國(guó) Thermo Finnigan公司).

1.2 窩兒七次生物質(zhì)的提取分離

取窩兒七干燥莖根粉末1 kg，加φ為95%的乙醇溶液浸沒(méi)生藥粉，加熱回流2 h，過(guò)濾，殘?jiān)偌应諡?5%乙醇溶液回流1 h，濃縮乙醇提取物至糖漿狀，放冷，傾入500 mL水中，黃棕色樹(shù)脂狀沉淀析出.濾集沉淀，得窩兒七樹(shù)脂.將樹(shù)脂研碎后用三氯甲烷450 mL分3次分散溶解，分成三氯甲烷溶解部分和不溶部分.

將三氯甲烷溶解部分蒸出三氯甲烷后，殘?jiān)诒胶挺諡?5%乙醇的混合溶液(體積比1∶1)中重結(jié)晶，放置過(guò)夜，得鬼臼毒素.將不溶物采用硅膠反復(fù)柱層析，用石油醚/乙酸乙酯(體積比 100∶0、80∶20、50∶50)溶液洗脫得4'-去甲基鬼臼毒素.

1.3 鬼臼毒素類似物結(jié)構(gòu)鑒定

采用FINNIGAN TRACE GC-MSTM分析化合物結(jié)構(gòu)［10］.氣相色譜進(jìn)樣口溫度230℃，載氣為氦氣，流速5 mL·min-1，非極性柱 BP-5［30 m ×0.32 mm ×0.25 mm］，初始柱溫100℃保持5 min，以10℃·min-1程序升溫至200℃，保持5 min，以5℃·min-1線性升溫至 220 ℃，保持 3 min，分流比20∶1.TR201818 MSTM:電壓70 eV，質(zhì)核比 m/z35～335 amu，借助 Wiley＆Mainlib數(shù)據(jù)庫(kù)分析化合物結(jié)構(gòu).

1.4 窩兒七化合物不同濃度對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的

非選擇性和選擇性拒食作用的測(cè)定

將化合物鬼臼毒素、4'-去甲基鬼臼毒素用φ為50%丙酮溶液和φ為0.3%吐溫水溶液配制成500、1 000、2 000、3 000 和4 000 μg·mL-15 個(gè)質(zhì)量濃度.采集較嫩的甘藍(lán)無(wú)蟲(chóng)孔葉片，選擇葉面平整，厚度接近的葉片，用打孔器(d=1.8 cm)制備成圓形葉片.用小毛筆蘸取適量溶液，每片葉片正反面均勻涂藥2次，晾干.對(duì)照葉片涂未加待測(cè)樣品的空白溶液.用培養(yǎng)皿和透明塑料硬紙制成高為10 cm的養(yǎng)蟲(chóng)籠，下方培養(yǎng)皿中放置潮濕濾紙保濕.上方的培養(yǎng)皿用保鮮薄膜封好，防止蟲(chóng)子跑出.

非選擇性拒食作用的測(cè)定:每個(gè)籠子放6片涂樣小葉，接10頭黃曲條跳甲成蟲(chóng)，為1個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù).24和48 h后分別用九宮方格圖版記錄成蟲(chóng)取食面積.

選擇性拒食作用的測(cè)定:培養(yǎng)皿中濾紙用鉛筆畫(huà)1個(gè)“十”，將其平均分成4個(gè)區(qū)域，其中不相鄰的區(qū)域放涂有試樣的葉片4片，并作上標(biāo)記，另外2個(gè)區(qū)域放空白對(duì)照的葉片4片，接10頭黃曲條跳甲成蟲(chóng)，為1個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù).24和48 h后分別用九宮方格圖版記錄成蟲(chóng)取食面積.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1.3分析數(shù)據(jù)，非選擇性拒食活性采用DMRT法進(jìn)行分析，選擇性拒食活性采用T檢驗(yàn)法分析.對(duì)差異顯著者，按下列公式計(jì)算拒食率，差異不顯著者，不計(jì)算拒食率.

拒食率=(對(duì)照組取食面積-處理組取食面積)/對(duì)照組取食面積×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 鬼臼毒素及其類似物結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 鬼臼毒素及其類似物的分子式Fig.1 Molecular structural formula of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin

2.2 窩兒七化合物不同質(zhì)量濃度對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的非選擇性拒食作用

由表1可知，鬼臼毒素對(duì)照與處理差異顯著，具有非選擇性拒食活性，并隨著質(zhì)量濃度增加，拒食活性增加.在 24 h，濃度 500 μg·mL-1時(shí)，拒食率為43.49%，4 000μg·mL-1時(shí)，拒食率達(dá)93.79%，但濃度在1 000～4 000μg·mL-1范圍內(nèi)的拒食活性差異不顯著.除3 000～4 000μg·mL-1濃度下的拒食活性差異不顯著外，48 h各組間拒食活性差異顯著，其拒食活性均低于相同濃度條件下24 h的拒食活性，但下降不顯著.相同條件下，不同濃度4'-去甲基鬼臼毒素處理組與對(duì)照組就拒食活性均無(wú)顯著差異.

表1 鬼臼毒素和4'－去甲基鬼臼毒素對(duì)黃曲條跳甲的非選擇性拒食活性1)Tab.1 Nonselective antifeedant activities of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin against Phyllotreta striolata

2.3 窩兒七化合物不同質(zhì)量濃度對(duì)黃曲條跳甲成蟲(chóng)的選擇性拒食作用

由表2可知，鬼臼毒素對(duì)照與處理差異顯著，具有選擇性拒食活性，隨著質(zhì)量濃度增加，拒食活性增加.在500μg·mL-1時(shí)，24 h拒食率為46.12%，4 000 μg·mL-1時(shí)，24 h拒食率達(dá)最大，為100%.相等質(zhì)量濃度下，48 h的拒食活性均比對(duì)應(yīng)的24 h的活性略低，但下降不顯著.4'-去甲基鬼臼毒素在1 000和4 000μg·mL-1濃度下24 h表現(xiàn)出拒食活性，4 000 μg·mL-1下48 h表現(xiàn)出拒食活性(53.03%)，其余拒食活性表現(xiàn)不顯著.

表2 鬼臼毒素，4'－去甲基鬼臼毒素對(duì)黃曲條跳甲的選擇性拒食活性1)Tab.2 Selective antifeedant activities of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin against Phyllotreta striolata

3 結(jié)論

植食性昆蟲(chóng)主要借助化學(xué)感受器來(lái)鑒別植物信號(hào)，而植物信號(hào)以植物次生物質(zhì)為主.從鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素對(duì)黃曲條跳甲的拒食研究可知，鬼臼毒素在24和48 h對(duì)黃曲條跳甲的選擇性拒食活性均高于非選擇性拒食活性，表明鬼臼毒素對(duì)黃曲條跳甲具有更好的選擇性拒食活性，且有一定的持效性.相比之下，4'-去甲基鬼臼毒素只在高濃度(4 000μg·mL-1)條件下，對(duì)黃曲條跳甲才表現(xiàn)出選擇性拒食活性.鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素分子結(jié)構(gòu)骨架相似，但拒食活性研究結(jié)果差異很大，可能與分子母核上所帶官能團(tuán)不同有關(guān).鬼臼毒素比4'-去甲基鬼臼毒素多1個(gè)甲基，拒食活性也隨之增大，推測(cè)可能是羥基的氫鍵作用阻礙了4'-去甲基鬼臼毒素與相關(guān)受體的結(jié)合，從而降低了拒食活性.類似作用也表現(xiàn)在鬼臼毒素的其他衍生物上，如鬼臼毒素C-4位引入氨基二苯醚基團(tuán)后，發(fā)現(xiàn)該衍生物的選擇性和殺蟲(chóng)范圍增強(qiáng)，其殺蟲(chóng)活性也得到一定程度的提高［15］.

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【責(zé)任編輯霍 歡】