杜志榮，張 琳，陰 彬，彭小忠

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100005）

哺乳動物大腦皮質(zhì)的發(fā)育長期以來都是發(fā)育生物學(xué)研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前用于研究大腦發(fā)育的組織化學(xué)技術(shù)主要有原位雜交技術(shù)和免疫熒光染色，而這些技術(shù)均需要前期的標(biāo)本制備，尤其是取材后的組織固定。組織固定的主要目的是盡可能保持組織內(nèi)待檢測物的原位性、完整性和免疫活性［1］，所以組織固定的效果往往決定著組化實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的成敗。4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）因其優(yōu)良的理化性質(zhì)成為目前固定標(biāo)本組織的常用固定劑之一［2－3］，而關(guān)于其配制方法，尤其是用于溶解它的溶劑的選擇目前還未有定論。本研究以此問題為出發(fā)點(diǎn)，比較不同溶劑的4%PFA對鼠腦組織的固定效果，探討最佳的組織固定方法。

1 材料與方法

1.1 材料:1）實(shí)驗(yàn)動物:SPF級懷孕的CD1小鼠，雌性，取材時的孕期分別為 10.5 d（E10.5）、E11.5、E12.5、E16.5d（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物處）。2）化學(xué)試劑:0.1 mol/L PB緩沖液（pH 7.4）:81 mmol/L Na2HPO4，19 mmol/L NaH2PO4;0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）:NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L（上海生工公司）;PFA（Sigma公司）;Pax6抗體和Ctip2抗體（Abcam公司）;地高辛抗體（Roche公司）。3）RNA探針:所需cDNA均從小鼠大腦中獲得，連接于pGEM-3zf載體，利用單酶切線性化質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄后再乙醇沉淀回收RNA探針。

1.2 切片制備:1）標(biāo)本采集:CD1孕鼠斷頸處死，剖腹，將胚胎取出后放入預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液中，E12.5及更早的胚胎整胚固定，E16.5鼠胚取腦，浸入4%PFA（0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB）固定過夜。第2天用25%蔗糖溶液（0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB）脫水，24 h后包埋，于－80℃冰箱中冷凝備用。2）切片:以16 μm厚度切片。

1.3 原位雜交:組織切片于4%PFA 20 min，PK緩沖液（2 μg/mL蛋白酶 K）常溫 10 min，再 DEPC-4%PFA 10 min，0.1 mol/L三乙醇胺（不含RNA酶）常溫?cái)嚢?0 min，常溫預(yù)雜交1 h，65℃雜交過夜（探針終濃度為0.5 ng/μL）;65℃0.2×檸檬酸鈉緩沖液 洗20 min ×3次，地高辛抗體1∶5 000，4 ℃孵育過夜;利用四唑硝基藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（Roche）系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)，使用純水終止反應(yīng)，放到100%甲醇中處理20 min，封片，拍照。

1.4 免疫熒光染色:組織切片于1×PBS中浸泡5 min，封閉液室溫封閉20～30 min，一抗4℃過夜（一抗稀釋比例:Pax6 1∶200，Ctip2 1v500）;1×PBS洗5 min×3次，二抗（1∶200）室溫孵育1.5～2 h，PBS洗5 min×3次，DAPI染色，室溫3～5 min，1×PBS洗3 min×1次，封片，用Olympus confocal共聚焦熒光顯微鏡P1000拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 原位雜交結(jié)果:可見4%PFA（0.1 mol/L PB）固定的組織不僅較4%PFA（0.01 mol/L PBS）的致密和形態(tài)完好，而且原位雜交背景也明顯降低，明顯提高了信噪比（圖1）。

2.2 免疫熒光染色結(jié)果:如圖可見，轉(zhuǎn)錄因子PAX6蛋白抗體用0.01 mol/L PBS免疫熒光染色的結(jié)果更清楚、背景更低;而用0.1 mol/L PB則較模糊和高背景，CTIP2蛋白抗體用0.01 mol/L PBS的非常清晰，而0.1 mol/L PB的結(jié)果卻幾乎不能用于實(shí)驗(yàn)分析（圖2）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過比較兩種緩沖系統(tǒng)的PFA固定小鼠大腦組織后的原位雜交、免疫熒光染色的結(jié)果的差別，發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L PB作為溶劑固定的組織更適合原位雜交，而0.01 mol/L PBS更適合于免疫熒光染色。但造成這一差異的具體機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

總之，為了得到較好的原位雜交和免疫熒光的結(jié)果，不僅需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和熟練的技術(shù)，而且還要注意根據(jù)待固定的組織特性和具體的實(shí)驗(yàn)條件來選擇不同緩沖系統(tǒng)的固定液。

圖1 不同溶劑配制的4%PFA對小鼠胚腦ngn1基因原位雜交結(jié)果的影響Fig 1 Effects of different solvent mixture of paraformaldehyde on in situ hybridization results of ngn1 gene in mouse embryo brain（×60）

圖2 不同溶劑配制的4%PFA對E16.5小鼠胚腦PAX6、CTIP2蛋白免疫熒光染色結(jié)果的影響Fig 2 Effects of different solvent mixture of paraformaldehyde on immunofluorescent staining results of pax6/ctip2 genes in mouse E16.5 brain（×100）

［1］賁長恩，李叔庚.組織化學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:10－12.

［2］雷種，成丹丹，王百忍，等.局灶性腦缺血再灌注后大鼠下丘腦pSTAT3陽性神經(jīng)細(xì)胞分布與局部微血管的關(guān)系［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2007，27:827 －830.

［3］Wilcox JN.Fundamental principles of in situ hybridization［J］.J Histochem Cytochem，1993，41:1725 －1733.