徐小彬(綜述)，譚 晶(審校)

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，昆明 650101)

RNA干擾是一種外源性雙鏈RNA抑制細胞內同源基因表達的現象，通過外源性雙鏈RNA在mRNA水平關閉相應序列及基因表達使目的基因沉默，這是一種轉錄后基因沉默。RNA干擾具有高效、特異、快速的特點，其在腫瘤基因治療領域應用廣泛。

端粒酶具有特殊的結構和功能，其激活與惡性腫瘤發(fā)生密切相關。端粒酶抑制劑被認為是一類潛在的高選擇性的抗癌藥物，抑制劑的研究為惡性腫瘤的早期診斷和基因治療開辟了新途徑。

目前以抑制端粒酶活性為靶點的惡性腫瘤治療方案不斷出現，盡管作用的環(huán)節(jié)各不相同，但都是以抑制端粒酶活性為目的。

1 端粒、端粒酶與腫瘤的關系

1.1端粒的特殊作用 端粒是真核細胞染色體末端的特殊結構，其生物學作用是維持染色體穩(wěn)定，保證染色體DNA完全復制，阻止遺傳信息丟失，維持基因組完整，防止染色體末端彼此黏著，參與染色體在核內的空間分布。端粒長度是決定細胞增殖能力與壽命的分子標志[1]。

1.2端粒酶的活性 人端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，由人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、人端粒酶RNA組分(human telomerase RNA，hTR)以及人端粒酶相關蛋白1(telomerase associated protein 1，TEP1)組成。端粒酶利用其自身hTR所攜帶的RNA為模板，在hTERT的逆轉錄催化下，將端粒重復序列合成到染色體末端。TEP1主要功能是調節(jié)端粒酶的活性[2]，它含有與端粒DNA互補的RNA模板，可以結合在端粒DNA上，通過使有轉錄活性的蛋白部分延伸，從而解決了真核細胞分裂中的末端復制問題，維持端粒的長度[3]。

1.3端粒酶與腫瘤的關系 端粒酶的激活與腫瘤的發(fā)生密切相關，在80%～90%的人原發(fā)腫瘤和腫瘤細胞系中可檢測出端粒酶活性(如前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、肝癌、肉瘤等)，而在正常人體組織中卻無表達(除生殖細胞、一些淋巴細胞和造血干細胞外)[4]。1994年Kim等[5]利用端粒重復擴增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)檢測了101種腫瘤標本和100個獨立的永生細胞系，發(fā)現90種腫瘤標本和98個永生細胞系中有端粒酶活性，而在良性腫瘤及正常體細胞中未發(fā)現端粒酶活性。Hiyarma等[6]采用TRAP檢測胰腺癌標本的端粒酶活性，發(fā)現43例中有41例呈現陽性，而11例胰腺良性腫瘤標本均為陰性。葉遠紅等[7]檢測胰腺癌患者胰液中的端粒酶活性，結果31例胰腺癌患者中19例端粒酶活性陽性，3例胰腺良性腫瘤患者中有1例端粒酶活性陽性，6例非胰腺疾病患者中端粒酶活性均為陰性。鐘英強等[8]應用鏈霉親和素-生物素復合物法(strept avidin-biotin complex,SABC)檢測38例胰腺癌、25例胰腺炎、20例正常胰腺組織中hTERT的表達，結果顯示正常胰腺組織及慢性胰腺炎組織中hTERT不表達。許元鴻等[9]研究的39例胰腺癌中，36例端粒酶表達陽性，11例胰腺良性病變均未檢出端粒酶的陽性表達。因此，端粒酶重新激活是癌變細胞一個帶有普遍性意義的生物學標志，被認為是細胞癌變的一個重要細胞生物學異常事件，是細胞永生化及腫瘤發(fā)生的關鍵步驟[10]。

2 RNA干擾的特點

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨多種基因的異常，這些異常表達基因的蛋白產物與正常組織細胞的同類蛋白并無差異[11]，因此在蛋白水平不能很好地區(qū)分正常細胞與惡性腫瘤細胞。基因變異往往反映在mRNA水平上，這就使RNA干擾技術得以應用。

2.1RNA干擾的作用機制 RNA干擾機制的特性在于外源性雙鏈RNA的引發(fā)及細小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)的引導干擾作用。

整個過程首先是在ATP存在的條件下，外源性雙鏈RNA通過細胞膜進入細胞，由胞質的Dicer酶切割為21～23 bp的siRNA，隨后siRNA與具有核酸內切酶活性的Argonaute2等[12]蛋白酶結合，形成RNA誘導的沉默復合物。此復合物可以把攜帶的雙鏈siRNA變成單鏈siRNA。含單鏈siRNA的沉默復合物具有活性，可與目的mRNA結合，導致目的mRNA斷裂、降解，從而導致目的基因沉默。

2.2RNA干擾與腫瘤的關系 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不但涉及原癌基因的激活，也與抑癌基因的失活密切相關。原癌基因包括腫瘤血管生成因子[13](血小板源性生長因子、表皮生長因子受體及血管內皮生長因子)、Ras相關蛋白[14]、端粒酶重要組成成分(hTERT、hTR及TEP1)等。抑癌基因包括野生型P53抑制基因、細胞周期蛋白B1調控亞基、凋亡抑制蛋白、Bcl家族促凋亡基因、浸潤和轉移調控基因黏著斑激酶、Ezrin蛋白、免疫抑制因子等[15-21]。理論上，腫瘤整個發(fā)生、發(fā)展過程中所涉及的基因或蛋白都可以成為RNA干擾的靶點，以此基因或蛋白設計出的siRNA可靶向沉默其表達，從而達到抑制腫瘤生長或促進細胞凋亡的目的。

3 RNA干擾與端粒酶抑制劑

端粒酶抑制劑類抗腫瘤藥的設計主要以hTERT、hTR以及TEP1為對象。這一類生物制劑中，以端粒酶hTERT和hTR與腫瘤關系最為密切，也是腫瘤反義藥物的主要靶點。

3.1以端粒酶hTERT為靶點的抑制劑 hTERT基因與腫瘤關系最為密切。研究表明，hTERT是調節(jié)端粒酶活性的決定性因素[22]。利用端粒酶hTERT啟動子靶向基因治療可選擇性地殺死端粒酶陽性的腫瘤細胞。

丁昂等[23]研究hTERT-siRNA對人膽囊癌細胞(GBC-SD細胞)代謝、侵襲及端粒酶活性的影響時發(fā)現，抑制hTERT基因的表達可同時降低端粒酶活性。宋玉姣等[24]通過設計的Ad-VEGF-shTERT重組腺病毒質粒，能顯著抑制端粒酶反轉錄酶的表達，通過抑制端粒酶的活性，抑制鼻咽癌CNE-2細胞增殖并誘導其凋亡。在前期試驗中設計的重組質粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-hTERT-siRNA通過脂質體轉染胰腺癌細胞Panc-1，從體內和體外整體水平上證實了siRNA下調hTERT的表達，體現出良好的RNA干擾沉默效應，并且也證實了其對胰腺癌細胞有抑制生長、促進凋亡的作用。

腺病毒攜帶的質粒能方便聚集于腫瘤細胞而對正常細胞無影響，提高了病毒對腫瘤殺傷的特異性[25]。不管是腺病毒還是脂質體攜帶hTERT-siRNA都對正常細胞無影響，針對siRNA的多種方法攜帶進入細胞內而起到沉默效應，載體的選擇上可能與研究的細胞系的特異性以及試驗差異性有關。

3.2以端粒酶hTR為靶點抑制劑 hTR是構成端粒酶的重要結構，因此通過特異性封閉其活性區(qū)域，可以抑制hTR活性，阻斷其轉錄或翻譯過程，達到降低端粒酶的活性的目的[26]。李燕等[27]構建腺病毒Ad-hTR-siRNA可以有效、特異地抑制hTR基因表達，誘導體外培養(yǎng)的HeLa腫瘤細胞凋亡，具有抗腫瘤活性。李婉宜等[28]將設計的hTR-siRNA腺病毒注入宮頸癌移植瘤，發(fā)現腺病毒能夠顯著抑制裸鼠人宮頸癌移植瘤的生長。徐鋒等[29]通過構建以hTR基因為靶點的RNA干擾裝置PhTR-siRNA，檢測PhTR-siRNA對BIU-87細胞的生物學效應，發(fā)現膀胱尿路上皮癌BIU-87細胞株的生長及端粒酶活性明顯受到抑制。

3.3以端粒酶TEP1為靶點的抑制劑 端粒酶蛋白亞單位作為一種抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。TEP1及其蛋白抗體是構成端粒酶不可缺少的部分，破壞端粒酶蛋白亞的結構使其失活，便可抑制端粒酶活性。研究發(fā)現，TEP1與腫瘤mRNA、血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶的表達調控密切相關[30]，但是以端粒酶TEP1為靶點的研究報道較少，原因可能與尚無滿意的人類端粒酶蛋白抗體有關[31]。

4 結 語

相對于其他類型的抗腫瘤藥物，腫瘤對于端粒酶抑制劑類不易產生耐藥性，且與傳統(tǒng)化療藥物的細胞毒性不同，以端粒酶為靶向的藥物可減少對正常細胞的毒副作用。目前研究已證實端粒酶抑制劑可與腫瘤的放、化療協(xié)同，增加其治療的敏感性[32-34]。端粒酶基因治療的優(yōu)勢使其有望成為治療的新方案。

并非所有腫瘤細胞端粒酶的活性都呈現高表達狀態(tài)，端粒酶抑制劑對端粒酶活性較高、端粒相對較短的腫瘤細胞可能發(fā)揮更大的作用。某些癌基因家族中的多個基因往往具有同源性很高的保守序列，可以針對這些保守序列設計出特異的雙鏈RNA，產生多個基因同時剔除的表型，理論上可以產生更大的沉默基因表達效率[35-36]。

[1] 張景澤,楊智勇,丁鵬.端粒酶抑制劑用于腫瘤治療的研究新進展[J].中國老年學雜志,2009,29(7):903-905.

[2] 左利娟,李洪雪.端粒酶抑制劑研究進展[J].中國實用醫(yī)藥,2010,5(5):225-228.

[3] Burger AM.Highlights in experimental therapeutics[J].Cancer Lett,2007,245(1/2):11-21.

[4] Bravaccini S,Casadio V,Amadori D,etal.The current role of telomerase in the diagnosis of bladder cancer[J].Indian J Urol,2009,25(1):40-46.

[5] Kim NW,Patyszek MA,Prowse KR,etal.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266(5193):2011-2015.

[6] Hiyama E,Kodama T,Shinbara K,etal.Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors[J].Cancer Res,1997,57(2):326-331.

[7] 葉遠紅,郝菁華,楊崇美.胰液端粒酶活性檢測在胰腺疾病鑒別診斷中的價值[J].腫瘤防治雜志,2003,10(4):383-385.

[8] 鐘英強,沈溪明,李海剛,等.hTERT在人胰腺癌組織中的表達及其與COX-2、P-gp、Bcl-2蛋白表達和臨床病理特征的關系[J/CD].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2008,2(8):877-885.

[9] 許元鴻,富偉能,郭仁宣.胰腺癌端粒酶活性的研究[J].中華消化雜志,2000,20(6):427-428.

[10] 陳陵,余松濤,梁光萍,等.端粒酶促進腫瘤細胞侵襲與轉移及其機制研究[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(5):13-20.

[11] 懷娜,馬秀梅.RNAi技術在腫瘤研究領域中的進展[J].內蒙古醫(yī)學雜志,2009,41(5):573-576.

[12] Liu J,Carmell MA,Rivas FV,etal.Argonaute 2 is the catalytic engine of mammalian RNAi[J].Science,2004,305(5689):1437-1441.

[13] 韓慶旺,樊燕榮,傅更鋒,等.RNA干擾對VEGF在人卵巢癌細胞中表達及細胞增殖的影響[J].第二軍醫(yī)大學學報,2005,26(9):992-996.

[14] 邢方凱,羅鵬,張吉強,等.Ral家族與腫瘤[J].生命的化學,2012,32(3):211-216.

[15] 霍興華,閆長虹.P53與腫瘤關系的研究進展[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2011,32(12):1973-1974.

[16] Bae DS,Cho SB,Kim YJ,etal.Aberrant expression of cylin D1 is associated with poor prognosis in early stage cervical cancer of the uterus[J].Gynecol Oncol,2001,81(3):341-347.

[17] Huang R,Zhao Z,Ma X,etal.Targeting of tumor radioiodine therapy by expression of the sodium iodide symporter under control of the survivin promoter[J].Cancer Gene Ther,2011,18(2):144-152.

[18] 梁妍,郭浩冰.腫瘤免疫治療中Bcl-2家族蛋白與凋亡蛋白抑制因子IAP研究[J].現代診斷與治療,2012,23(9):1412-1413.

[19] Tsutsumi K,Kasaoka T,Park HM,etal.Tumor growth inhibition by synthetic and expressed siRNA targeting focal adhesion kinase[J].Int J Oncol,2008,33(1):215-224.

[20] 張義鳳,盧玉波,楊宏英,等.EZRIN蛋白與婦科腫瘤侵襲轉移關系研究進展[J].現代腫瘤醫(yī)學,2010,18(11):2276-2279.

[21] Moore LD,Isayeva T,Sieqal GP,etal.Silencing of transforming growth factor-beta1 in situ by RNA interference for breast cancer:implications for proliferation and migration in vitro and metastasis in vivo[J].Clin Cancer Res,2008,14(15):4961-4970.

[22] 楊仕明,房殿春,楊金亮,等.人端粒酶蛋白催化亞單位反義基因轉染對胃癌細胞惡性表達型的逆轉作用[J].第三軍醫(yī)大學學報,2001,23(8):934-937.

[23] 丁昂,童賽雄,馮平,等.hTERT-siRNA抑制膽囊癌細胞端粒酶活性及增殖運動的研究[J].武漢大學學報：醫(yī)學版,2006,27(3):287-290.

[24] 宋玉姣,韓繼波,陳始明,等.腺病毒介導的shRNA沉默hTERT基因表達對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響[J].腫瘤防治研究,2011,38(12):1351-1355.

[25] Vchino J,Takayama K,Harada A,etal.Infectivity enhanced.hTERT promoter-based conditionally replicative adenoviruses are useful for SCLC treatment[J].Cancer Gene Ther,2005,12(9):737-748.

[26] 朱曉應,符偉軍,洪寶發(fā).端粒酶與腫瘤靶向治療[J].國外醫(yī)學遺傳學分冊,2005,28(6):366-368/353.

[27] 李燕,肖麗英,姚剛,等.hTR-siRNA腺病毒的構建及其體外抗腫瘤的初步研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2008,24(6):570-573.

[28] 李婉宜,李明遠,肖麗英,等.hTR-siRNA腺病毒對裸鼠人宮頸癌移植瘤的治療作用[J].四川大學學報：醫(yī)學版,2008,39(5):711-714.

[29] 徐鋒,蘇筠,程文,等.RNA干擾hTR基因對膀胱尿路上皮癌BIU-87細胞株端粒酶活性的影響[J].醫(yī)學研究生學報,2009,22(6):587-591.

[30] 郭鷺,曲巍.TEP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展[J].中國現代普通外科進展,2012,15(8):635-636.

[31] 顏芹,齊元富.端粒酶與腫瘤[J].深圳中西醫(yī)結合雜志,2011,21(4):248-251.

[32] 董俊紅,王振明,付新華,等.RNAi沉默survivin表達對A549細胞凋亡及紫杉醇敏感性的影響[J].腫瘤防治研究,2010,37(3):266-269.

[33] Alli E,Yang JM,Ford JM,etal.Reversal of Stathmin-Mediated resistance to paclitaxel and vinblastine in human breast carcinoma cells[J].Mol Pharmacol,2007,71(5):1233-1240.

[34] Tan J,Zhou X,Zhu H.hTERT-siRNA Could Potentiate the Cytotoxic Effect of Gemcitabine to Pancreatic Cancer Cells Bxpc-3[J].Exp Clin Transplant,2012,10(4):386-393.

[35] Wilda M,Fuchs U,W?ssmann W,etal.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference(RNAi)[J].Oncogene,2002,21(37):5716-5724.

[36] Hu Y,Shen Y,Ji B,etal.Combinational RNAi gene therapy of hepatocellular carcinoma by targeting human EGFR and TERT[J].Eur J Pharm Sci,2011,42(4):387-391.