張 偉(綜述)，王文氫(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，石家莊 050011)

1992年，F(xiàn)ujiwara等[1]描述了一個臨床和病理組織學(xué)改變類似大皰性類天皰瘡的表皮下水皰病患者。免疫印跡分析顯示患者血清沒有與BPAG1和BP180反應(yīng)，而是識別了一個相對分子質(zhì)量為45×104的表皮多肽，這個表皮多肽在人類角質(zhì)形成細(xì)胞和一些像HeLa、KB、A431系的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中表達(dá)[2]。經(jīng)研究，該抗原是plakin家族的成員,由于來源于表皮,故命名為Epiplakin(EPPK)，其獨特的分子結(jié)構(gòu)使EPPK具有區(qū)別于其他家族成員的特征。

1 EPPK的組織定位

EPPK分布廣泛，EPPK在單層上皮及復(fù)層上皮都有定位。EPPK主要分布在肝臟、小腸、結(jié)腸、腮腺、腎、闌尾中，在胎盤、肺、腦、脊髓中分布較少[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在頭發(fā)[4]、成年鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞和馬勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、鼠胚胎視網(wǎng)膜、nestin陽性神經(jīng)祖細(xì)胞[5]及胚胎早期及成年期胰腺、胰腺祖細(xì)胞和胚胎分化細(xì)胞[6]中也有EPPK表達(dá)。

2 EPPK的基因結(jié)構(gòu)及分子結(jié)構(gòu)

EPPK分子在人類和鼠類組織中均有表達(dá)，但種屬不同，其基因結(jié)構(gòu)及分子結(jié)構(gòu)也不完全相同，有各自的特點。

2.1人類EPPK的基因結(jié)構(gòu)及分子結(jié)構(gòu) 編碼人類EPPK的EPPK基因(EPPK1)是一個plakin家族基因，位于人類染色體8q24.3。根據(jù)2003年4月的UCSC人類基因瀏覽器(http://genome.ucsc.edu)，EPPK1長度為7524 bp。

EPPK1有獨特的結(jié)構(gòu)：僅有1個15 195 kb的外顯子，包含13個亞單元，編碼13個核苷酸序列高度同源的plakin重復(fù)結(jié)構(gòu)域(PRDs)，最后5個亞單位幾乎是完全相同的；研究發(fā)現(xiàn)在EPPK基因3′末端的5個同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)部分含有三核苷酸(GCC)n的重復(fù)序列，它們編碼聚丙氨酸。為了研究該分子的多態(tài)性，Takeo等[7]分離了15個健康人的DNA，運用套式聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增EPPK 3′末端的5個同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域的第一個，結(jié)果顯示正常人(GCC)n重復(fù)分布具有多態(tài)性，在5～9最多見的重復(fù)數(shù)為8，15條染色體中有5條是在第5個重復(fù)的GCC中有從G到A轉(zhuǎn)錄。說明這些個體微衛(wèi)星區(qū)域存在多樣性。

人類EPPK的分子結(jié)構(gòu)與同屬于plakin家族成員的橋粒蛋白不盡相同。幾乎所有的plakin家族成員分子結(jié)構(gòu)都有一個共性：有一個球狀N端，C端的結(jié)構(gòu)域被一個中央桿狀結(jié)構(gòu)域隔開。橋粒蛋白是由球狀N端、中央螺旋桿樣結(jié)構(gòu)域和C端的3個同源PRDs，A、B、C結(jié)構(gòu)域和富含甘氨酸-絲氨酸-精氨酸結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成。PRDs是由38個氨基酸中4.5個副本構(gòu)成，橋粒蛋白B和C亞結(jié)構(gòu)分析顯示獨特折疊球狀結(jié)構(gòu)[8]。

人類EPPK分子重要的特征是具有13個PRDs，13個PRDs與首次在橋粒蛋白C端發(fā)現(xiàn)的B結(jié)構(gòu)域更相似，B結(jié)構(gòu)域可以分為兩部分：一部分約70%是橋粒蛋白B結(jié)構(gòu)域(3、6、8和13結(jié)構(gòu)域)；另一部分45%～50%是橋粒蛋白B結(jié)構(gòu)域(1、2、4、5和7結(jié)構(gòu)域)。而且，9和13結(jié)構(gòu)域及這5個結(jié)構(gòu)域之后的連接區(qū)幾乎完全相同。在EPPK分子中沒有發(fā)現(xiàn)螺旋桿樣結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域，序列中沒有發(fā)現(xiàn)二聚體，表明EPPK在活體中可能以單鏈結(jié)構(gòu)存在[3]。

2.2鼠類EPPK的基因結(jié)構(gòu)及分子結(jié)構(gòu) 鼠類EPPK1位于鼠第15號染色體的中間區(qū)域，分析顯示鼠的EPPK1包含一個不編碼的外顯子1、一個大的(-20 kb)編碼外顯子2及一個內(nèi)含子。

鼠EPPK分子結(jié)構(gòu)與人類EPPK不同，C端可識別的幾乎完全相同重復(fù)結(jié)構(gòu)數(shù)目有8個。人和鼠EPPK分子B結(jié)構(gòu)域的相似度比連接區(qū)的相似度更明顯，如人類和鼠類對應(yīng)的第9個B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列大約90%相同，而對應(yīng)的連接區(qū)的氨基酸序列大約63%相同。與人EPPK分子B結(jié)構(gòu)域相似，鼠的B結(jié)構(gòu)域中，Ⅰ組與網(wǎng)蛋白第1個B結(jié)構(gòu)域相比有約70%完全相同(3、6和8～16結(jié)構(gòu)域)：Ⅱ組與網(wǎng)蛋白第1個B結(jié)構(gòu)域相比有約50%或更少的相同程度(1、2、4、5和7結(jié)構(gòu)域)[8-9]。

雖然人類和鼠類EPPK的B結(jié)構(gòu)域高度同源，但兩種屬的連接區(qū)相對不同。連接區(qū)中的三核苷酸(GCC)n的重復(fù)序列僅位于人類EPPK1，因此微衛(wèi)星長度異常導(dǎo)致的遺傳性皮膚病和核苷酸重復(fù)區(qū)域異常導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病僅限于人類[7]。

3 EPPK的功能

大多數(shù)plakin都是大分子，有特定的結(jié)構(gòu)域，例如肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋狀螺旋桿結(jié)構(gòu)域和PRDs。這些結(jié)構(gòu)域通過與細(xì)胞骨骼相互作用錨定在膜結(jié)合復(fù)合體上維持組織的完整性[10]。同其他plakin家族成員一樣，EPPK是個大分子，然而，EPPK缺少中間部分的螺旋桿樣結(jié)構(gòu)域及N端球狀結(jié)構(gòu)域[3]。在活體中，EPPK獨特的重復(fù)結(jié)構(gòu)域毫無疑問會影響到其分子功能[11]。

3.1人類EPPK與中間絲 Jang等[12]運用免疫染色、疊加分析和RNAi剔除法研究人類EPPK的作用時發(fā)現(xiàn)，重復(fù)單元(PRD+連接區(qū))與角蛋白的結(jié)合力很強，也觀察到與波形蛋白的結(jié)合，只是作用較弱。EPPK基因剔除顯示單層上皮中間絲(intermediate filaments，IF)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的崩解。拯救實驗表明重復(fù)單元阻止了IF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的崩解，推測EPPK在單層上皮細(xì)胞中參與維持IF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性。為進(jìn)一步檢測EPPK與IF的結(jié)合能力，Wang等[13]利用包含有EPPK的一個結(jié)構(gòu)單元及亞結(jié)構(gòu)單元的融合蛋白行狹縫印跡(slot-blot)分析，結(jié)果顯示B結(jié)構(gòu)域結(jié)合角蛋白至少需要4.6個拷貝中的2個。增加EPPK連接區(qū)內(nèi)的重復(fù)結(jié)構(gòu)的數(shù)目，EPPK與IF的結(jié)合力也會增強。在此研究中也檢測到EPPK與波形蛋白和肌間線蛋白有相似的結(jié)合，只是結(jié)合力較弱。實驗結(jié)果表明，EPPK的B和連接區(qū)結(jié)構(gòu)域與中間絲間存在相互作用，EPPK的B和連接區(qū)結(jié)構(gòu)域中的高度重復(fù)結(jié)構(gòu)在分子的功能中起到了至關(guān)重要的作用。

3.2鼠類EPPK與中間絲

3.2.1正常情況下鼠類EPPK與中間絲 為了進(jìn)一步研究EPPK的功能，Goto等[11]和Spazierer等[14]分別作出了EPPK基因剔除鼠(EPPK-/-鼠)。EPPK-/-鼠與野生鼠表現(xiàn)型無明顯差異：發(fā)育正常，表皮及毛發(fā)正常，有生育能力。Spazierer等[14]研究發(fā)現(xiàn)盡管EPPK在復(fù)層及單層上皮大量并高特異性表達(dá)，但鼠EPPK缺失未導(dǎo)致嚴(yán)重的皮膚功能障礙。Spazierer等[15]運用體外結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有鼠的EPPK的16PRDs與基底角質(zhì)形成細(xì)胞的角蛋白結(jié)合。然而，在角質(zhì)形成細(xì)胞初代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)EPPK僅與部分IF網(wǎng)狀構(gòu)造共存。通過角蛋白過度磷酸化、滲透性休克或紫外線照射方式給予細(xì)胞應(yīng)力，整個胞質(zhì)EPPK均與角蛋白結(jié)合。Time-course實驗顯示，絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸酶抑制物誘導(dǎo)的IF崩解速度在EPPK缺乏的分化角質(zhì)形成細(xì)胞中的比野生鼠快。作者認(rèn)為在應(yīng)力存在的條件下EPPK對IF重建起到了重要作用，可能通過伴侶蛋白的方式抗崩解來保護(hù)IF[15]。

3.2.2創(chuàng)傷情況下鼠類EPPK與角蛋白 Goto等[11]發(fā)現(xiàn)EPPK-/-鼠背部創(chuàng)傷愈合速度較野生鼠和雜交鼠快。對EPPK剔除和EPPK過度表達(dá)的HeLa細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)EPPK剔除HeLa細(xì)胞的移動速度顯著增高，而EPPK過度表達(dá)的HeLa細(xì)胞的移動速度明顯被抑制[16]。野生鼠傷口邊緣，在增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的EPPK與K6連接。在EPPK-/-鼠中未發(fā)現(xiàn)類似的增殖角質(zhì)形成細(xì)胞，但是遷移的角質(zhì)形成細(xì)胞微弱地表達(dá)K6。在野生鼠外植體培養(yǎng)的一些角質(zhì)形成細(xì)胞中EPPK與K6共表達(dá)，提示EPPK可能與K6存在功能上的聯(lián)系。

Ishikawa等[17]進(jìn)一步研究野生鼠和EPPK-/-鼠在無創(chuàng)傷和有創(chuàng)傷情況下EPPK與角蛋白的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在無創(chuàng)傷的表皮中，與其他蛋白相比，EPPK更多地與角蛋白17(K17)共存。創(chuàng)傷后，EPPK-/-鼠和野生鼠中K5、K10、K6和K17的表達(dá)相同，但EPPK-/-鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中角蛋白絲更細(xì)。創(chuàng)傷野生鼠的免疫染色電鏡顯示EPPK與K5、K10和K6共存。提示在創(chuàng)傷愈合過程中，增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞EPPK加速角蛋白成束。

3.3EPPK的標(biāo)記作用 EPPK1不僅在皮膚組織表達(dá)，在其他組織也檢測到了EPPK1。Yoshida等[5]在成年鼠視網(wǎng)膜中檢測到EPPK1 mRNA和蛋白，在胚胎視網(wǎng)膜nestin陽性細(xì)胞、成年鼠中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞和馬勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中都有EPPK1表達(dá)，表明EPPK1與視網(wǎng)膜的發(fā)育有關(guān)。Yoshida等[6]在胚胎期胰腺上皮中發(fā)現(xiàn)了EPPK1+/Pdx1+和EPPK1+/Sox9+胰腺祖細(xì)胞。此后，EPPK1的表達(dá)局限在Ngx3+或Sox9+分泌祖細(xì)胞和p48+外分泌祖細(xì)胞中，在出生時EPPK表達(dá)局限在導(dǎo)管細(xì)胞和α細(xì)胞以及成年鼠胰腺中央腺管細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞中。先前被認(rèn)為是胰腺導(dǎo)管腺癌前期損傷的胰腺上皮內(nèi)瘤中檢測到了EPPK1。另外，因蛙皮素引起的急性胰腺炎(一種acinar細(xì)胞再生模型)，EPPK1陽性細(xì)胞也增多。EPPK1對檢測發(fā)育和重生胰腺的胰腺祖細(xì)胞來說是一種有用的標(biāo)志物[6]。

Matsuo等[18]研究鼠發(fā)育和再生的肝臟時發(fā)現(xiàn)EPPK1在初期的雙向分化潛能的肝母細(xì)胞表達(dá)，以后限于在膽管細(xì)胞表達(dá)。出生后，EPPK1在膽管表達(dá)。在含乙硫氨酸無膽堿飼養(yǎng)的鼠肝臟中，EPPK1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加并表達(dá)A6，表明此細(xì)胞為肝臟祖細(xì)胞。某些EPPK1陽性細(xì)胞表達(dá)一種增殖標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原，證明這些細(xì)胞是短暫的增殖細(xì)胞。所以，EPPK1可以作為探測發(fā)育中及成年肝臟中祖細(xì)胞的標(biāo)志物。

3.4其他 Steiner等[4]研究鼠毛囊內(nèi)毛根鞘交叉連接的蛋白，發(fā)現(xiàn)毛透明蛋白與EPPK交叉連接在毛囊的內(nèi)毛根鞘細(xì)胞角化膜中，扮演了交叉橋架增強蛋白的角色。Fabre等[19]試圖識別腹瀉綜合征的致病基因，運用直接序列測定或結(jié)合分析，最終排除了EPPK1。Blagoev等[20]研究表皮生長因子受體通路時檢測到信號分子EPPK與表皮生長因子受體-Src同源膠原蛋白特異性結(jié)合形成復(fù)合物。

4 結(jié) 語

截止目前，EPPK在人類及鼠類中的基因和分子結(jié)構(gòu)已全部探明，并證實了人類EPPK分子具有個體多態(tài)性，EPPK基因剔除鼠模型已制成，EPPK在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，在機械外力下維持細(xì)胞完整性的作用正在進(jìn)一步研究中。隨著對EPPK的深入研究，其與微衛(wèi)星異常長度導(dǎo)致的遺傳性皮膚病和核苷酸重復(fù)區(qū)域異常導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系，EPPK分子在廣泛分布的各種組織中的重大作用將會被逐漸發(fā)現(xiàn)。

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