陳磊

HPLC-MS/MS同時(shí)檢測烏龍茶中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸殘留

陳磊

（國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福建），福建 安溪 362400）

建立了基于HPLC-MS/MS同時(shí)檢測烏龍茶中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的分析方法，3種農(nóng)藥的檢出限均為0.1 ng/mL，定量限為0.2～0.3 ng/mL，回收率在91 %～102 %之間，能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)烏龍茶中草銨膦和草甘膦（含氨甲基膦酸）限量的檢測要求，并利用所建立的分析方法，對(duì)福建市場上的140個(gè)茶葉產(chǎn)品的上述農(nóng)殘進(jìn)行檢測，均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量。

HPLC-MS/MS，烏龍茶，草銨膦，草甘膦，氨甲基膦酸

草甘膦（Glyphosate，簡寫PMG）和草銨膦（Glufosinate-ammonium，簡寫GLUF）是廣譜非選擇性除草劑，廣泛用于控制一年生和多年生雙子葉及禾本科雜草，它們的機(jī)制在于對(duì)植物中的酶抑制[1]，能干擾植物中的氨基酸和其他化學(xué)成分的形成[2]。由于這2種除草劑在全球范圍內(nèi)的廣泛使用，以及歐盟對(duì)其在水中殘留的嚴(yán)格限定，檢測其殘留的精密方法是十分必要的。然而，因?yàn)槠渚哂须x子性、低揮發(fā)性、小分子量等特點(diǎn)，使得低于μg/L水平的檢測較困難[3]。目前已報(bào)道的草銨膦、草甘膦以及代謝物氨甲基膦酸（（Aminomethyl）phosphonic acid，簡寫AMPA）的分析方法，包括氣相色譜[2]、液相色譜[4-5]、毛細(xì)管電泳、氣質(zhì)聯(lián)用儀、液質(zhì)聯(lián)用儀[6-7]和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜[8]等方法，但從這3種化合物的物理、化學(xué)特性來看，比較適合的是基于液相分析的方法。但因?yàn)樗鼈兊姆肿恿啃?、化學(xué)基團(tuán)少和缺失發(fā)色團(tuán)、紫外或熒光吸收等緣故，大多數(shù)的分析方法都需要采用衍生程序增強(qiáng)對(duì)分析物的分析。柱前和柱后衍生都有應(yīng)用，柱前程序有與氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-CL）衍生化形成熒光衍生物（提高檢測）和/或減少極性的被分析物的色譜保留。在柱后的程序最常見的是與鄰苯二甲醛（OPA）和巰基乙醇或OPA和N,N-二甲基-2-巰基乙胺反應(yīng)[9]。

草甘膦和草銨膦雖然對(duì)人體健康不存在主要風(fēng)險(xiǎn)，但有證據(jù)表明其暴露在環(huán)境中，可引起人體神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]。草甘膦廣泛濫用給環(huán)境帶來了許多污染問題，引起了人們對(duì)食品中草甘膦含量水平的關(guān)注[11]。有研究表明草銨膦對(duì)人類的生殖系統(tǒng)有毒性作用[12]。我國的國家標(biāo)準(zhǔn)中將對(duì)茶葉中的草甘膦和草銨膦最大殘留限量值限定為 1 mg/kg、0.5 mg/kg，而目前尚沒有檢測草銨膦的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。

本文研究建立了一種基于HPLC-MS/MS（高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜）結(jié)合固相萃取技術(shù)（SPE），同時(shí)測定烏龍茶中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸（其分子結(jié)構(gòu)見圖1）的分析方法。并利用所建立的方法，檢測了我國部分茶類中草銨膦、草甘膦（含氨甲基膦酸）的殘留水平，評(píng)價(jià)茶葉中草銨膦、草甘膦的安全性，以期能更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)茶葉的消費(fèi)安全。

圖1 草銨膦（GLUF）、草甘膦（PMG）和氨甲基膦酸（AMPA）分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Molecular structure of glufosinate (GLUF), glyphosate (PMG) and (aminomethyl) phosphonic acid (AMPA)

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1290/6460 HPLC-MS/MS（配置Waters BEH C18 高效液相柱）；水浴超聲清洗器；渦旋混勻器；高效粉碎機(jī)；數(shù)字氣浴振蕩器；離心機(jī)；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；超純水器。草銨膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品均為Dr. Ehrenstorfer（德國）公司生產(chǎn)；草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品為農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所生產(chǎn)。通過甲醇稀釋/溶解以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制備100 μg/mL儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液以及工作標(biāo)準(zhǔn)液，保存在－5 ℃，儲(chǔ)備液保存期3個(gè)月，工作液保存期1個(gè)月。實(shí)驗(yàn)用水是Mili?Q水（18.2 MΩ/cm）；色譜用的流動(dòng)相試劑：乙酸銨（色譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)）均為美國ROE公司生產(chǎn)，乙腈（色譜級(jí)）為美國TEDIA公司生產(chǎn)；四硼酸鈉（分析純）；氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl，分析純，純度不低于99.0%）。

1.2樣品前處理

稱取2.5 g烏龍茶樣品，放入50 mL具塞塑料離心管中，加50 mL水，充分振蕩1 min，45℃水浴超聲提取30 min，4000 r/min離心10 min，取上層澄清提取液5 mL，過C18-N小柱，棄去前2 mL流出液，收集后3 mL流出液。然后，吸取600 μL該流出液，加入200 μL 30 g/L硼酸鈉溶液和200 μL 1.0g/L FMOC-Cl乙腈溶液，渦旋振蕩1 min后，室溫放置2 h衍生。最后，4000 r/min離心10 min，將上清液過0.45 μm有機(jī)相濾膜，濾液用于HPLC-MS/MS 檢測。

1.3分析方法

液相色譜柱是Waters BEH C18 柱（2.1×100 mm，1.7 μm），柱溫40℃，進(jìn)樣量5.0 μL，流動(dòng)相流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為0.01 mol/L 乙酸銨溶液（甲酸調(diào)節(jié)pH=4.0），流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫：0.0～4.0min：10%B（V/V）逐漸線性增至60%B，4.0～4.1 min：60%B逐漸線性增至80%B，4.1～6.0 min：保持80%B，6.0～6.1 min：80%B逐漸線性降至10%B，保持10%B駐留2 min。

質(zhì)譜儀是ESI離子源，正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），脫溶劑氣溫度300 ℃；脫溶劑氣流速 8 L/min，霧化氣壓力35 psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管電壓4000 V。用于3種農(nóng)藥測定的參數(shù)見表1：

表1 草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸衍生后化合物在液質(zhì)聯(lián)用儀上的檢測參數(shù)Table 1 Detection parameters of Glufosinate, glyphosate and (aminomethyl) phosphonic acid derivatives in HPLC-MS/MS

2 結(jié)果與討論

2.1檢測前處理優(yōu)化

草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸均易溶于水，不易溶于有機(jī)溶劑，所以一般草甘膦和草銨膦農(nóng)藥被加工成水劑農(nóng)藥。有研究報(bào)道，選取水和丙酮作為提取試劑提取大豆、米和小麥等試樣中的草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸，提取效果良好[2,8]。也有人利用硼酸鹽溶液提取玉米中的草銨膦，回收率較好[13]。本文首先對(duì)提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，分別選取了水、水和丙酮混合溶劑、硼酸鹽溶液和氫氧化鈉溶液[14]作為提取試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有丙酮的提取劑，提取出的色素較多，對(duì)凈化提出了更高的要求；而硼酸鹽和氫氧化鈉溶液提取劑提取的溶液中，雜質(zhì)較多，衍生后產(chǎn)生渾濁并出現(xiàn)較多沉淀。而水作為提取試劑時(shí)，提取液色素和雜質(zhì)均較少，同時(shí)提取回收率在90%以上，而且操作簡便、試驗(yàn)成本低。所以選擇水作為提取溶劑。

對(duì)提取方式的優(yōu)化比較了常溫振蕩提取、恒溫振蕩提取和水浴超聲提取等，發(fā)現(xiàn)水浴超聲提取的效果較好，而且溫度較易控制。另外在提取時(shí)間上，超聲提取30 min提取回收率已能滿足實(shí)驗(yàn)要求，而恒溫振蕩提取需40 min以上，才能充分提取。從提高效率的角度，本文最終選擇水浴45℃條件下的超聲提取30 min。

經(jīng)過上述超聲提取后，提取液中含有少量的色素和多酚類物質(zhì)，色素和多酚類物質(zhì)對(duì)后面的衍生化反應(yīng)有抑制作用，需凈化處理?？紤]到C18是強(qiáng)疏水性硅膠基質(zhì)吸附劑，對(duì)非極性化合物具有強(qiáng)保留特性。本文嘗試選用Cleanert C18-N SPE和Cleanert S C18 SPE小柱（過柱時(shí)小柱預(yù)先先用5 mL甲醇和5 mL水活化），移取5 mL提取液到預(yù)淋洗后的小柱中，棄去前面2 mL流出液，收集后面3 mL流出液[14-15]，然后再取收集到的后面3 mL流出液用于衍生化反應(yīng)。最后選取Cleanert C18-固相萃取小柱。

衍生化反應(yīng)首先需保證反應(yīng)完全，衍生化試劑氯甲酸-9-芴基甲酯需足量，但過量的氯甲酸-9-芴基甲酯會(huì)造成反應(yīng)的溶液渾濁，不好過濾膜，對(duì)儀器也有一定的損傷。經(jīng)過優(yōu)化，移取凈化后的溶液60 μL，分別加入200 μL 30 g/L硼酸鈉溶液、200 μL 1. g/L氯甲酸-9-芴基甲酯乙腈溶液，室溫下衍生反應(yīng)至少2 h，衍生化反應(yīng)充分。

2.2儀器條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)比較了兩種C18液相色譜柱（Waters BEH C18，2.1×100mm，1.7μm和Agilent Zorbax SB-C18，2.1×150mm，3.5μm）的分離和峰型效果結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的峰型較干凈、對(duì)稱，分離效果也較好，所以選其作為高效液相的分離色譜柱。對(duì)色譜柱柱溫，流動(dòng)相的試劑、流量和梯度洗脫等均進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見1.3所述：

茶葉基質(zhì)中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸與氯甲酸-9-芴基甲酯衍生后，在質(zhì)譜上正離子模式的響應(yīng)值明顯高于負(fù)離子模式。正離子模式條件下，草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸與氯甲酸-9-芴基甲酯衍生物在全掃描質(zhì)譜后，得到的母離子[M + H]+，分別為m/z= 404、m/z =392和m/z= 334，定量和定性離子分別為（m/z= 136，208）、（m/z= 88，214）和（m/z= 179，112）。草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸與氯甲酸-9-芴基甲酯衍生化反應(yīng)及其在質(zhì)譜離子化后定量和定性離子碎片示意圖如下圖2所示。從圖中也可以看出，本文所選取的定量離子的碎片，一般為分子量較小或穩(wěn)定性強(qiáng)的；而所選取的定性離子的碎片，一般較易產(chǎn)生，敏感性強(qiáng)，更能代表該碎片形成的方式。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)化

在上述最優(yōu)條件下，草甘膦、氨甲基膦酸和草銨膦混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和它們?cè)跒觚埐杌|(zhì)中的總離子圖（TIC）和提取離子的色譜圖如下圖3所示。

從圖3可清楚地觀察到3種農(nóng)藥在4.0 min內(nèi)完全分離，沒有任何干擾。為了獲得校準(zhǔn)曲線我們分析檢測了一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、和50 ng/mL），其線性方程、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及其檢出限見下表2。

圖2 FMOC-Cl衍生化后草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸在HPLC-MS/MS檢測中的主要碎片離子A：草銨膦（GLUF）；B：草甘膦（PMG）； C：氨甲基膦酸（AMPA）Fig. 2 Major fragment ions in HPLC-MS/MS detection of glufosinate, glyphosate and (aminomethyl) phosphonic acid after derivatization with FMOC-Cl A: glufosinate (GLUF); B: glyphosate (PMG); C: (aminomethyl) phosphonic acid (AMPA)

表2 液質(zhì)聯(lián)用儀檢測草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和方法檢出限Table 2 Standard curve regression equation and detection limits of glufosinate, glyphosate and (aminomethyl) phosphonic acid in HPLC-MS/MS detection method

從表2中IUPAC（國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)）方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），分別以3.84和10倍空白溶液信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算。EURACHEM（歐洲分析化學(xué)中心）方法LOQ，待測目標(biāo)物信號(hào)的RSD%為10%時(shí)的濃度。如表2所示，這3種農(nóng)藥的IUPAC檢出限均為0.1 ng/mL，定量限在0.2～0.3 ng/mL之間，EURACHEM定量限均為0.5 ng/mL。中國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1923-2007《進(jìn)出口食品中草甘膦殘留量的檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》對(duì)茶葉中草甘膦（含氨甲基膦酸）的定量限為0.10 mg/kg，而本文方法對(duì)草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸3種農(nóng)藥殘留的定量限均為0.02 mg/kg。

為了驗(yàn)證方法的可靠性，利用以上的檢測方法對(duì)茶葉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明茶葉樣品中3種農(nóng)藥殘留的平均加標(biāo)回收率為91 %～ 102 %,6次重復(fù)測定的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1 %～3 % 和3 %～6 %之間。

圖3 分別為10 ng/mL草甘膦（PMG）、氨甲基膦酸（AMPA）和草銨膦（GLUF）標(biāo)準(zhǔn)溶液在烏龍茶基質(zhì)中的總離子圖和提取的各定量離子色譜圖A:混合標(biāo)液；B:草銨膦的定量離子色譜圖；C:草甘膦的定量離子色譜圖；D:氨甲基膦酸的定量離子色譜圖。Fig. 3 TIC and extracted quantitative ion chromatogram of respectively 10 ng/mL of glyphosate (PMG), (aminomethyl) phosphonic acid (AMPA) and glufosinate (GLUF) standard solution in the tea matrix.A: mixed standard solution; B: GLUF quantitative ion chromatogram; C: PMG quantitative ion chromatogram; D: AMPA quantitative ion chromatogram.

2.4茶葉樣品的檢測結(jié)果

利用本文所建立的方法對(duì)福建省市場上的140個(gè)茶葉產(chǎn)品進(jìn)行檢測，其中烏龍茶128 份、綠茶4份、紅茶3份、普洱茶3份和白茶2份。結(jié)果草銨膦殘留均未檢出，與林永輝等的檢測研究相同，原因可能是草銨膦的價(jià)格較高，因此在國內(nèi)茶葉種植中使用較少[14]。有35個(gè)茶葉樣品有檢出草甘膦（草甘膦和氨甲基膦酸殘留量之和）。若將檢測的草甘膦含量（X）大小分為四個(gè)區(qū)間：即X＜LOD（檢出限LOD為0.04 mg/kg），LOD＜X＜0.1，0.1≤X≤1.0，X＞1.0。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，X＜LOD的樣品有105個(gè)，LOD＜X＜0.1的樣品有17個(gè)，0.1≤X≤1.0的樣品有18個(gè)，沒有X＞1.0的樣品。即140個(gè)茶葉樣品中草甘膦均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2012中的限量值，所測茶葉樣品中草甘膦含量的分布圖如圖4所示。但是抽樣的烏龍茶、綠茶、紅茶和普洱茶中均有檢出草甘膦，只有白茶沒有檢出，說明草甘膦作為除草劑，在茶園中的施用較為普遍，未發(fā)現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象，但25%的檢出率表明草甘膦類除草劑的施用應(yīng)加以管控，防止草甘膦殘留量增高，影響飲茶安全。

3 結(jié)論

圖4 茶葉樣品中草甘膦殘留量的分布圖Fig. 4 Distribution map of glyphosate residues in tea samples

本研究建立了HPLC-MS/MS同時(shí)檢測茶葉中草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸的分析方法，提取和前處理方法簡單、快速，檢測方法能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)烏龍茶中草銨膦和草甘膦限量的檢測要求。利用所建立的方法，分析檢測了采集福建省市場上的140個(gè)茶葉樣品中的草銨膦、草甘膦和氨甲基膦酸殘留情況，均未檢出草銨膦殘留，有35個(gè)樣品檢出含有草甘膦殘留（包含氨甲基膦酸），但其含量均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量值，但是25%的檢測率也足以反映出草甘膦在茶葉種植過程中施用的普遍性，國家標(biāo)準(zhǔn)已規(guī)定其限量，茶葉在種植過程中應(yīng)盡量減少草甘膦的使用。

[1] C. D. S. Tomlin. World Compendium-The Pesticide Manual,Thirteenth Edition[M], BCPC(British Crop Protection Council): Hampshire, UK. 2003.

[2] Tseng S H, Lo Y W, Chang P C, et al. Simultaneous Quantification of Glyphosate, Glufosinate, and Their Major Metabolites in Rice and Soybean Sprouts by Gas Chromatography with Pulsed Flame Photometric Detector[J]. J. Agric. Food Chemistry, 2004, 52: 4057-4063.

[3] Ibá?ez M, Pozo ó J, Sancho J V, et al. Residue determination of glyphosate, glufosinate and aminomethylphosphonic acid in water and soil samples by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1081: 145-155.

[4] Patsias J, Papadopoulou A, Papadopoulou-Mourkidou E. Automated trace level determination of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid in water by on-line anion-exchange solid-phase extraction followed by cation-exchange liquid chromatography and post-column derivatization[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 932: 83-90.

[5] Hori Y, Fujisawa M, Shimada K, et al. Quantitative determination of glufosinate in biological samples by liquid chromatography with ultraviolet detection after p-nitrobenzoyl derivatization[J]. Journal of Chromatography B, 2002, 767: 255-262.

[6] Ibá?ez M, Pozo ó J, Sancho J V, et al. Re-evaluation of glyphosate determination in water by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1134: 51-55.

[7] 李波,鄧曉軍,郭德華,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中的草甘膦及其主要代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸殘留[J].色譜,2007,25(4):486-490．

[8] Goodwina L, Startinb J R, Keelya B J, et al. A nalysis of glyphosate and glufosinate by capillary electrophoresis–mass spectrometry utilising a sheathless microelectrospray interface[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 1004: 107-119.

[9] Durán Merás I, Galeano Díaz T, Alexandre Franco M. Simultaneous fluorimetric determination of glyphosate and its metabolite, aminomethylphosphonic acid, in water, previous derivatization with NBD-Cl and by partial least squares calibration(PLS) [J]. Talanta, 2005, 65: 7-14.

[10] Grichar W J, Prostko E P. Effect of glyphosate and fungicide combinations on weed control in soybeans[J]. Crop Protection, 2009, 28: 619-622.

[11] Coutinho C F B, Coutinho L F M, Mazo L H, et al. Direct determination of glyphosate using hydrophilic interaction chromatography with coulometric detection at copper microelectrode [J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 592: 30-35.

[12] Schulte-Hermann R, Wogan G N, Berry S C, et al. Analysis of reproductive toxicity and classification of glufosinate-ammonium[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2006, 44: S1-S76.

[13] Qian K, He S, Tang T, et al. A rapid liqui chromatography method for determination o glufosinate residue in maize after derivatisatio [J]. Food Chemistry, 2011, 127：722-726.

[14] 林永輝,劉正才,楊方,等．柱前衍生化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中草銨膦的殘留量[J].色譜,2012, 30(12):1260-1264．

[15] 曹趙云,牟仁祥,陳銘學(xué)．液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定稻米中的草甘膦和氨甲基膦酸殘留[J].色譜,2010, 28(8):743-748．

Simultaneous Detection of Glufosinate, Glyphosate and （Aminomethyl）Phosphonic Acid in Oolong Tea by HPLC-MS/MS

CHEN Lei
（National Tea Quality Supervision and Inspection Center （Fujian），Anxi，F(xiàn)ujian 362400，China）

A method for simultaneous determination of glufosinate, glyphosate and (aminomethyl) phosphonic acid residues in Oolong tea by HPLC-MS/MS was described. The method has a LOD of 0.1 ng/mL, a LOQ of 0.2～0.3 ng/mL and a recovery of 91%～102%. The method can meet the national standard detecting requirements for the MRL of glufosinate and glyphosate（containing （aminomethyl） phosphonic acid） in Oolong tea. By using the proposed method, we had determined 140 tea samples collected from Fujian market, which indicated that all these samples conformed to the MRL of the national standard of above-mentioned pesticide residues.

HPLC-MS/MS, Oolong tea, glufosinate, glyphosate, (aminomethyl) phosphonic acid

陳磊（1981-），男，工程師，研究方向：食品安全與藥物化學(xué)。Email: leon1981@126.com