常陸林

（河南省漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，漯河462002）

山楂總黃酮對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠酒精性肝病的影響

常陸林

（河南省漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，漯河462002）

目的研究山楂總黃酮對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠酒精性肝病的影響。方法以56%體積分?jǐn)?shù)白酒（1.5ml·100g-1）體重造模6周后，隨機(jī)分組，山楂黃酮低、中、高劑量組（5，10，20g·kg-1）和聯(lián)苯雙酯組（0.6g·kg-1），在酒精繼續(xù)灌胃的基礎(chǔ)上，按劑量給藥，1次·d-1，共12周。檢測(cè)小鼠血清和肝組織中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、肝勻漿中腫瘤壞死因子（TNF-α）含量。結(jié)果山楂總黃酮對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠酒精性肝病形成后SOD、GSH-PX的活性含量有回升作用，并能阻止與肝病相應(yīng)的ALT、AST活性及降低MDA、NO、TNF-a含量。結(jié)論山楂總黃酮對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠酒精性肝病有預(yù)防作用，可能與其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

山楂總黃酮；抗氧化；酒精性肝病

山楂為薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科落葉灌木北山楂和山里紅的干燥成熟果實(shí)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為山楂具有消積化滯，補(bǔ)脾健胃，活血化瘀等功用［1］。而現(xiàn)代研究證明，山楂中含豐富山楂黃酮，具有較強(qiáng)的清除自由基［2］抗氧化［3］、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞保護(hù)作用，以及具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理作用，本文采用白酒灌胃誘導(dǎo)的小鼠酒精性肝損傷模型，評(píng)價(jià)山楂黃酮給藥后對(duì)肝損傷組織的影響，并檢測(cè)血清中ALT、AST水平及肝組織勻漿中SOD、GSH-PX活性、MDA及NO、TNF-α含量，來(lái)觀察山楂黃酮的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1試劑聯(lián)苯雙酯（批號(hào)：081203）購(gòu)自濟(jì)南金達(dá)藥化有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)：080907）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)：061203）、一氧化氮（NO，批號(hào)：081115）、超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)：080314）、丙二醛（MDA，批號(hào)：080812）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-PX，批號(hào)：091203）測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成工程研究所；TNF-α測(cè)試試劑盒（批號(hào)：081207）購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，6～8周齡，雌雄兼用，18～22g；均由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)前于本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周，飼養(yǎng)條件為：溫度（22±3）℃，濕度50%～75%，光暗周期12h／12h，自由攝食、飲水。

1.3儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和自動(dòng)純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；超聲波發(fā)生器，昆山市超聲儀器有限公司；721分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；550型酶標(biāo)儀，Bio－RAD。

1.4受試藥物的制備山楂黃酮（產(chǎn)品批號(hào)20110523，西安小草生物技術(shù)有限公司，總黃酮純度≥90%）。用時(shí)以0.5%CMC-Na溶液溶解，制成混懸液，用于小鼠灌胃給藥。

1.5方法

1.5.1酒精性肝損傷動(dòng)物模型昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，聯(lián)苯雙酯組（0.6g·kg-1），山楂黃酮低、中、高劑量組（5，10，20g·kg-1），每組10只，喂養(yǎng)適應(yīng)1周后，除正常對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃外，其余各組進(jìn)行造模，以56%體積分?jǐn)?shù)白酒約1.5ml·100g-1體重（折合成乙醇為6.72g·kg-1體重，換算公式為：酒精重量（g）＝白酒體積（ml）×白酒酒精含量×酒精密度（0.8g· ml-1）每日清晨灌胃一次［4］。造模6周后，山楂黃酮治療組和聯(lián)苯雙酯組在繼續(xù)酒精灌胃的基礎(chǔ)上，按劑量給藥，1次·d-1，各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間均予以飲用水及全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒喂養(yǎng)，每周稱重2次，造模周期共12周。

1.5.2血清制備造模末次給藥24h后（禁食12h），稱重，以3%戊巴比妥麻醉，眼靜脈取血并處死。冰箱靜置2h以上，3000rqm離心15min，取上清分裝于塑料試管中，置冰箱（-20℃）中冷凍保存。

肝組織勻漿制備。取出肝臟，先用PBS沖洗2遍，然后用雙蒸餾水1∶5研磨成組織勻漿，3000rqm，10min離心后取上清液檢測(cè)。

1.5.3測(cè)定方法丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、肝勻漿中腫瘤壞死因子（TNF-α）含量均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，其中SOD、ALT、AST、NO、GSHPX及MDA用比色法測(cè)定；TNF-α用ELISA方法測(cè)定，所有比色均在96孔酶標(biāo)板中由550型酶標(biāo)儀完成。

1.6統(tǒng)計(jì)處理計(jì)量資料均以表示，應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05，表示有顯著性差異；P＜0.01，表示有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1山楂總黃酮對(duì)小鼠血清中ALT、AST水平的影響正常對(duì)照組與模型組比較，模型組ALT，AST水平明顯升高（P＜0.05），通過(guò)不同劑量的山楂總黃酮的治療，實(shí)驗(yàn)各組小鼠血清ALT，AST水平均有不同程度的降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈現(xiàn)一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1 山楂總黃酮對(duì)小鼠血清中ALT、AST水平的影響

表1 山楂總黃酮對(duì)小鼠血清中ALT、AST水平的影響

注：與模型組比較，1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs模型組，以下表格采用相同的表示方法

組別ALT／u·L-1AST／u·L-1正常對(duì)照組37．70±11．21）123．70±11．41）模型組113．20±13．1 195．80±24．9聯(lián)苯雙酯組51．11±13．212）132．80±12．31）山楂總黃酮低劑量組61．30±22．112）164．90±14．71）山楂總黃酮中劑量組61．20±17．231）144．70±12．21）山楂總黃酮高劑量組52．10±11．232）135．70±3．91）

2.2山楂黃酮對(duì)各組小鼠肝組織MDA、NO的影響正常對(duì)照組與模型組相比，模型組肝組織勻漿中MDA和NO明顯增加（P＜0.05；P＜0.01），說(shuō)明肝臟受到一定損傷，自由基增加，通過(guò)不同劑量的山楂總黃酮的治療組，MDA和NO均不同程度地降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（表2），說(shuō)明山楂總黃酮具有一定的抗氧化作用。

表2 山楂黃酮對(duì)小鼠肝組織MDA、NO含量的影響

表2 山楂黃酮對(duì)小鼠肝組織MDA、NO含量的影響

ro正常對(duì)照組1．37±0．152）2．77±0．211）組別MDA／nmol·mg-1pro NO／μmol·g-1p模型組3．45±0．34 4．57±0．38聯(lián)苯雙酯組1．47±0．242）3．41±0．321）山楂總黃酮低劑量組3．14±0．492）4．21±0．14山楂總黃酮中劑量組1．57±0．361）3．47±0．242）山楂總黃酮高劑量組1．77±0．272）3．14±0．371）

2.3山楂總黃酮對(duì)各組小鼠肝組織GSH-PX、SOD的影響模型組GSH-PX、SOD較空白對(duì)照組明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明酒精對(duì)肝有一定的損傷作用，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)的減少。山楂總黃酮治療組與模型組相比，實(shí)驗(yàn)各組小鼠肝組織GSH-PX、SOD水平均有不同程度的升高，與陽(yáng)性對(duì)照有類似的治療效果（P＜0.05或P＜0.01），治療效果并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表3。

表3 山楂總黃酮對(duì)小鼠肝組織GSH-px、SOD含量的影響

表3 山楂總黃酮對(duì)小鼠肝組織GSH-px、SOD含量的影響

rot正常對(duì)照組73．9±3．51）172．67±21．171）組別GSH-PX／U·mg-1pro SOD／U·mg-1p模型組34．21±9．1 81．12±11．34聯(lián)苯雙酯組64．4±4．31）142．74±24．211）山楂總黃酮低劑量組61．4±5．42）94．21±9．432）山楂總黃酮中劑量組64．3±3．51）121．91±25．172）山楂總黃酮高劑量組65．7±2．42）152．64±25．141）

2.4山楂總黃酮對(duì)各組小鼠肝組織TNF-α的影響模型組TNF-α較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），說(shuō)明酒精性肝損傷與氧化應(yīng)激有明顯的關(guān)系，引起細(xì)胞凋亡，山楂治療組與模型組相比，實(shí)驗(yàn)各組小鼠肝組織TNF-α水平均有不同程度的下降（P＜0.05或P＜0.01），各劑量山楂總組與模型組相比，均有明顯治療效果并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明山楂總黃酮對(duì)肝具有一定的保護(hù)作用，見(jiàn)表4。

表4 山楂總黃酮黃酮對(duì)各組小鼠肝組織TNF-α的影響

表4 山楂總黃酮黃酮對(duì)各組小鼠肝組織TNF-α的影響

注：**P＜0.01vs正常對(duì)照組；1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs模型組

ro正常對(duì)照組1．21±0．172）組別TNF-α／ug·mg-1p模型組2．74±0．26聯(lián)苯雙酯組1．41±0．271）山楂總黃酮低劑量組1．41±0．251）山楂總黃酮中劑量組1．54±0．152）山楂總黃酮高劑量組1．46±0．212）

3 討論

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，是西方國(guó)家導(dǎo)致肝硬化的最主要病因，也是十大常見(jiàn)死因之一［5］。

目前認(rèn)為，酒精性肝損傷的主要原因是酒精在肝臟內(nèi)代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物引起的代謝紊亂和營(yíng)養(yǎng)不良，研究報(bào)道乙醇可引起蛋氨酸代謝異常，導(dǎo)致燃燒脂肪的線粒體的衰敗，有人提出以脂質(zhì)過(guò)氧化為中心的“二次打擊”假說(shuō)［6］。還與組織繼發(fā)性缺氧［7］、肝炎病毒感染及遺傳和基因等因素有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)造模小鼠通過(guò)山楂黃酮治療，血清中ALT、AST水平較模型組有明顯下降，說(shuō)明山楂總黃酮能降低酒精引起急性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。各山楂總黃酮治療組均可不同程度地降低肝組織中MDA和NO，增加SOD、GSH-PX，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明山楂總黃酮具有一定的抗氧化作用，提示藥物能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用，減輕酒精對(duì)肝臟的損傷，能降低TNF-α水平，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。山楂總黃酮對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠酒精性肝病有預(yù)防作用，可能與其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典［S］．一部．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：22．

［2］Wang S．L．，Lee H．，Chen K．W．，et al．Cytochrome P4502E1 genetic polymorphisms and lung cancer in a Taiwanese population［J］．Lung Caneer，1999，26：27-34．

［3］Bartsch H．，Nair U．，Risch A．，et al．Genetic Polymorphism of CYPGenes，Alone or in Combination，as a Risk Modifier of Tobacco-related Cancers［J］．Cancer Epidemiology，Biomarkers＆Prevention January，2000，（9）：3-2．

［4］Fleming RE，Bacon BR．Orchestration of lron Homeostasis［J］．N Engl J Med，2005，352（17）：1741-1744．

［5］魯曉嵐，陶明，羅金燕，等．飲酒與肝病流行病學(xué)調(diào)查［J］．中華肝臟病雜志，2002，10（6）：467-468．

［6］Savas M．C．，Konlk M．，Pirim I．，et al．Serum ubiquitin levels in patients with nonalcoholic steatohepatitis［J］．Hepato-gastrocnterology，2003，50：738-741．

［7］Takei Y．，Sato N．，Kamada T．Ethanol-induced hepatic microcirculatory disturbance［J］．Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi，1999，34：107-116．

Ef f e c t o f To t al Fla v o ne o f Ha w t h o r n on Et h anol In d u c e d Alc o h olic Liv e r Dis ea s e in Mic e

Chang Lulin
（Luohe M ediCal College，Luohe 462002，china）

ObjectiveTo study the effect of total flavonoids of hawthorn on ethanol induced alcoholic liver disease in mice．MethodsAnimal model was established by 56%（v／v）（1.5ml·100－1）body，which were divided hawthorn flavonoids of low，middle and high dose grouq，（5，10，20g ·kg－1）and bifendate grouq（0.6g·kg－1）after 6 weeks．Every grouq was resqectively treated for 12 weeks with total flavonoids of hawthorn，bifendate or normal saline accordingly．The activities of alanine transaminase（ALT）asqartate transaminase（AST）in serum，suqeroxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），nitric oxide（NO），glutathione qeroxidase（GSH-PX）in liver homogenate，tumor necrosis factor（TNF-α）content were investigated．Resultsotal flavone of hawthorn can increase activity of SOD，GSH-PX，diseaseing ALT，AST activity and MDA，NO，TNF-a content．ConclusionHawthorn flavonoids have a preventiveeffect on alcoholic liver disease in mice induced by alcohol，which may be related to its antioxidant and immune regulation

Hawthorn flavonoids；Antioxidant；Alcoholic liver disease

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.07.105

：1672-2779（2014）-07-0152-02

蘇 玲 本文校對(duì)：李先佳

2013-12-18）