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（1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193）

西瓜炭疽病菌產(chǎn)毒條件優(yōu)化及其生物活性測(cè)定

唐爽爽1劉志恒1*余朝閣1鄭 川1李健冰1趙廷昌2

（1沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193）

針對(duì)西瓜炭疽病菌進(jìn)行了產(chǎn)毒條件優(yōu)化、粗毒素的生物活性及其理化性質(zhì)測(cè)定的研究。結(jié)果表明：不同的培養(yǎng)條件對(duì)病原菌粗毒素活性的影響不同，pH值為6的Richard培養(yǎng)液產(chǎn)生的粗毒素的生物活性最強(qiáng)，培養(yǎng)溫度25 ℃、黑暗條件下持續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d為最佳產(chǎn)毒條件。粗毒素接種西瓜莖蔓可產(chǎn)生與病菌作用相同的發(fā)病癥狀，對(duì)種子胚根生長(zhǎng)及種子萌發(fā)有抑制作用，對(duì)幼苗有致萎作用，說(shuō)明該粗毒素是西瓜炭疽病菌侵染過(guò)程中的主要致病因子。以病菌粗毒素接種10種供試植物，其中甜瓜、西葫蘆及草莓發(fā)病癥狀明顯，而番茄、茄子及辣椒均未見(jiàn)發(fā)病癥狀。

西瓜炭疽病菌；粗毒素；生物活性；理化性質(zhì)

西瓜（Citrullus lanatus Matsum.et Nakai）為葫蘆科，西瓜屬，一年生蔓生草本植物。其果瓤脆多汁，堪稱(chēng)“瓜中之王”。西瓜炭疽病由瓜類(lèi)炭疽菌〔Colletotrichum orbiculare（Berk.）Arx〕引起，在全世界西瓜產(chǎn)區(qū)幾乎均有發(fā)生，以濕潤(rùn)地區(qū)較為普遍。在我國(guó)遼寧省西瓜生產(chǎn)上，病害的影響歷年均居高不下，其中炭疽病的危害尤為嚴(yán)重。

毒素是植物病原菌產(chǎn)生的次生代謝物，是植物病程中起著決定作用的有毒物質(zhì)。關(guān)于炭疽病菌毒素國(guó)內(nèi)外曾有報(bào)道（Frantzen et al.，1982；張廣民 等，1995），但至今尚未見(jiàn)有關(guān)西瓜炭疽病菌毒素的研究報(bào)道，為此筆者對(duì)西瓜炭疽病菌毒素進(jìn)行了初步研究，探討產(chǎn)毒條件、提高毒素毒性的方法，為進(jìn)一步進(jìn)行西瓜炭疽病菌毒素的致病機(jī)制等深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

西瓜炭疽病標(biāo)樣于2012年8月采自沈陽(yáng)新民市、營(yíng)口蓋州市和阜新彰武縣。按常規(guī)組織分離方法（方中達(dá)，1998）分離病菌，經(jīng)純化及單孢分離獲得病菌純培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 西瓜炭疽病菌粗毒素濾液的制備

將供試西瓜炭疽病菌株移至PSA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，在長(zhǎng)勢(shì)均勻的菌落邊緣打取直徑8 mm的菌餅。挑取5塊菌餅接種于裝有100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，25 ℃恒溫黑暗條件下?lián)u床振蕩（150 r·min-1）培養(yǎng)20 d。將培養(yǎng)液先用8層無(wú)菌紗布濾去菌絲體，再用0.45 μm微孔膜加壓抽濾，獲得無(wú)菌濾液。將無(wú)菌濾液經(jīng)8 ℃，8 000 r·min-1離心20 min，上清液即為西瓜炭疽病菌粗毒素（徐凌飛 等，2009）。置于4 ℃下保存，備用。

1.3 產(chǎn)毒條件研究

1.3.1 不同培養(yǎng)液對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 試驗(yàn)選用5種培養(yǎng)液，pH值均調(diào)至7。

PS培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，加蒸餾水至1 000 mL。PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 000 mL。Richard培養(yǎng)液：KNO310 g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，F(xiàn)eCl30.02 g，蔗糖50 g，加蒸餾水至1 000 mL。Fries培養(yǎng)液：NaCl 0.1 g，KH2PO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，酒石酸銨5 g，酵母浸膏1.0 g，蔗糖30 g，加蒸餾水至1 000 mL。Czapek培養(yǎng)液：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，加蒸餾水至1 000 mL。

以上5種培養(yǎng)液分別接菌后，在25 ℃恒溫黑暗條件下?lián)u床持續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同培養(yǎng)液對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.3.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 Richard培養(yǎng)液接菌后，設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間5、10、15、20、25 d和30 d共6個(gè)處理，25 ℃恒溫黑暗條件下?lián)u床持續(xù)振蕩培養(yǎng)。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.3.3 不同pH值對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 將Richard培養(yǎng)液的pH值設(shè)置3、4、5、6、7、8、9、10、11共9個(gè)梯度，培養(yǎng)液接菌后，25℃恒溫黑暗條件下?lián)u床持續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d（蔣繼志等，2009）。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同pH值對(duì)粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.3.4 不同溫度對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響Richard培養(yǎng)液接菌后，設(shè)置5、10、15、20、25、30 ℃和35 ℃共7個(gè)溫度梯度，黑暗條件下?lián)u床持續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同溫度對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.3.5 不同光照對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響Richard培養(yǎng)液接菌后，設(shè)置光照、黑暗、光暗交替（光照12 h/黑暗12 h）共3個(gè)處理（Leach & Trione，1965；Smith & Fergus，1971），25 ℃恒溫條件下?lián)u床持續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同光照條件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.3.6 不同振蕩條件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 Richard培養(yǎng)液接菌后，設(shè)置靜置、間歇振蕩（12 h靜止/12 h振蕩）、持續(xù)振蕩3個(gè)處理，25℃恒溫黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)20 d。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同通氣量對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.3.7 接菌數(shù)量對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響分別向Richard培養(yǎng)液中接種1、3、5塊和7塊直徑8 mm的菌餅（李小波 等，2010），25 ℃恒溫黑暗條件下?lián)u床持續(xù)振蕩培養(yǎng)20 d。用1.2方法制備并提取粗毒素，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法和種子萌發(fā)抑制法，比較不同接菌數(shù)量對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.4 西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性測(cè)定

1.4.1 莖蔓針刺接種測(cè)定法 用無(wú)菌水清洗西瓜植株上的健康莖蔓，采用針刺法將浸有1 mL西瓜炭疽病菌粗毒素的脫脂棉覆蓋在傷口上，25 ℃保濕培養(yǎng)，96 h后觀察莖蔓處理部位的病變情況。以空白培養(yǎng)液為對(duì)照。

1.4.2 幼苗浸漬致萎測(cè)定法 取生長(zhǎng)一致3葉期約7 cm高的西瓜幼苗，無(wú)菌水清洗根部后移入盛有5 mL西瓜炭疽病菌粗毒素的試管中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，以空白培養(yǎng)液為對(duì)照。36 h后觀察幼苗致萎情況（潘陽(yáng) 等，2011）。

1.4.3 種子胚根生長(zhǎng)抑制法 將西瓜種子用0.1%升汞消毒1 min，無(wú)菌水清洗3次后置于含有無(wú)菌水的滅菌濾紙上，于25 ℃保濕培養(yǎng)、催芽。待48 h西瓜種子芽長(zhǎng)1～2 mm時(shí)，將其置于鋪有2層滅菌濾紙（濾紙上浸含10 mL西瓜炭疽病菌粗毒素）的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，25 ℃恒溫培養(yǎng)。以無(wú)菌水為對(duì)照。96 h后測(cè)量種子胚根長(zhǎng)度，計(jì)算胚根生長(zhǎng)抑制率。每處理3次重復(fù)。

1.4.4 種子萌發(fā)抑制法 取消毒后的西瓜種子于40℃水中浸泡1 h，將其置于鋪有2層滅菌濾紙（濾紙上浸含10 mL西瓜炭疽病菌粗毒素）的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，25 ℃恒溫培養(yǎng)。以無(wú)菌水為對(duì)照。96 h后測(cè)其萌發(fā)率，計(jì)算種子萌發(fā)抑制率。每處理3次重復(fù)。

1.4.5 不同植物對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素敏感性測(cè)定

分別選取茄子、番茄、辣椒、西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆、草莓和山藥10種幼苗，采用針刺法進(jìn)行處理，將浸有西瓜炭疽病菌粗毒素的脫脂棉覆蓋于經(jīng)針刺處理的各種植株葉片上，25 ℃保濕培養(yǎng)，96 h后觀察葉片針刺部位發(fā)病情況（陸寧海等，2007）。以空白培養(yǎng)液為對(duì)照。

1.5 西瓜炭疽病菌粗毒素性質(zhì)的初步測(cè)定

1.5.1 西瓜炭疽病菌粗毒素的提純 西瓜炭疽病菌粗毒素培養(yǎng)液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，將濃縮后的培養(yǎng)液分別加等體積的甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯和丙酮，萃取3次，得到萃取相和水相。合并3次萃取液，于60 ℃下減壓蒸干，用蒸餾水恢復(fù)至原液的體積。將各萃取有機(jī)相和水相部分進(jìn)行生物活性測(cè)定。

1.5.2 西瓜炭疽病菌粗毒素原液中蛋白質(zhì)及非蛋白質(zhì)部分毒性測(cè)定 向西瓜炭疽病菌粗毒素中加入2倍體積的無(wú)水乙醇靜置3 h，沉淀大分子蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，離心得沉淀蛋白質(zhì)和上清非蛋白質(zhì)組分。將蛋白質(zhì)部分蒸餾水回溶，非蛋白質(zhì)部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，分別進(jìn)行生物活性測(cè)定（劉守安 等，2007）。

1.5.3 熱處理對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響西瓜炭疽病菌粗毒素經(jīng)高溫（121 ℃）、高壓（0.103 MPa）處理20 min后取樣，以未經(jīng)任何處理的粗毒素作對(duì)照，采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法比較熱處理對(duì)粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.5.4 西瓜炭疽病菌粗毒素不同濃度對(duì)毒性的影響將西瓜炭疽病菌粗毒素用無(wú)菌水稀釋為原濃度的10%、20%、33.3%、50%和100%（黃秀萍 等，2012），采用種子胚根生長(zhǎng)抑制法比較不同濃度對(duì)粗毒素生物活性的影響。每處理3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS和Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)毒條件研究

2.1.1 不同培養(yǎng)液對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 采用西瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率和種子萌發(fā)抑制率的方法測(cè)定，抑制率越大則表示西瓜炭疽病菌粗毒素毒性越高。西瓜炭疽病菌在供試的5種培養(yǎng)液中均能產(chǎn)生粗毒素，但以Richard培養(yǎng)液中產(chǎn)生的粗毒素毒性最強(qiáng)，對(duì)西瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率達(dá)到92.38%，種子萌發(fā)抑制率達(dá)到93.98%。Fries和Czapek培養(yǎng)液中粗毒素活性次之，PD培養(yǎng)液與PS培養(yǎng)液的粗毒素對(duì)胚根生長(zhǎng)的抑制作用較弱（表1）。結(jié)果表明，Richard培養(yǎng)液對(duì)于西瓜炭疽病菌粗毒素的產(chǎn)生為最佳，毒性顯著高于供試的其他4種培養(yǎng)液，故后續(xù)試驗(yàn)均采用Richard培養(yǎng)液進(jìn)行不同處理?xiàng)l件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性影響的測(cè)定。

表1不同培養(yǎng)液對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

2.1.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 Richard培養(yǎng)液25 ℃暗培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，西瓜炭疽病菌粗毒素的毒性逐漸增加，至20 d時(shí)達(dá)到高峰，而后下降。培養(yǎng)5 d時(shí)種子胚根生長(zhǎng)抑制率為8.68%；培養(yǎng)20 d時(shí)胚根生長(zhǎng)抑制率及種子萌發(fā)抑制率均達(dá)到最高，分別為92.38%和93.98%；培養(yǎng)25 d時(shí)胚根生長(zhǎng)抑制率下降至81.26%，而培養(yǎng)30 d時(shí)胚根生長(zhǎng)抑制率降至70.94%。因此，西瓜炭疽病菌產(chǎn)毒培養(yǎng)時(shí)間以20 d為最佳（圖1）。

圖1不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

2.1.3 不同pH值對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 由圖2可知，在pH值 3～6時(shí)西瓜炭疽病菌粗毒素的毒性隨pH值的增長(zhǎng)而增強(qiáng)，在pH 值6時(shí)抑制率最大，胚根生長(zhǎng)抑制率為96.52%，種子萌發(fā)抑制率為96.80%；其后毒性隨pH值的增長(zhǎng)而下降，在pH 值11時(shí)毒性達(dá)到最低，胚根生長(zhǎng)抑制率為10.17%，種子萌發(fā)抑制率為8.58%?？梢?jiàn)弱酸性適宜產(chǎn)毒，而偏酸或偏堿條件均不適宜產(chǎn)毒。西瓜炭疽病菌產(chǎn)毒最適pH值為6。

2.1.4 不同溫度對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響西瓜炭疽病菌在Richard培養(yǎng)液5～35 ℃之間均可產(chǎn)毒，5～25 ℃時(shí)隨著溫度的升高病菌粗毒素的毒性不斷增強(qiáng)，25 ℃時(shí)達(dá)到高峰，胚根生長(zhǎng)抑制率為92.38%，種子萌發(fā)抑制率為93.98%；而后隨著溫度的升高，病菌粗毒素的毒性隨之下降，35℃時(shí)胚根生長(zhǎng)抑制率降至45.67%，種子萌發(fā)抑制率降至42.89%（圖3）。因此，西瓜炭疽病菌產(chǎn)毒的最適溫度為25 ℃。

圖2不同pH值對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

圖3不同培養(yǎng)溫度對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

2.1.5 不同光照對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響圖4表明，光照對(duì)西瓜炭疽病菌產(chǎn)毒具有抑制作用，此處理下胚根生長(zhǎng)抑制率為75.89%，種子萌發(fā)抑制率為81.11%。光暗交替條件抑制作用次之，而黑暗條件為產(chǎn)毒最適條件，胚根生長(zhǎng)抑制率為92.38%，種子萌發(fā)抑制率為93.98%。

2.1.6 不同振蕩條件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 測(cè)定結(jié)果表明，不同振蕩條件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響差異顯著。持續(xù)振蕩最適于西瓜炭疽病菌毒素的產(chǎn)生；間歇振蕩培養(yǎng)條件下，病菌產(chǎn)毒受到一定程度的抑制；而靜置條件則不利于病菌產(chǎn)毒，此處理下胚根生長(zhǎng)抑制率僅為33.56%，種子萌發(fā)抑制率為35.22%（圖5）。

2.1.7 不同接菌數(shù)量對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響 由圖6可知，在Richard培養(yǎng)液中接菌數(shù)量從1塊到5塊不斷增加時(shí)，胚根生長(zhǎng)抑制率及種子萌發(fā)抑制率逐漸上升，接菌數(shù)量為5塊時(shí)抑制率達(dá)到最高。7塊時(shí)有所降低，其原因可能是菌碟數(shù)量太多導(dǎo)致培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，致使西瓜炭疽病菌粗毒素毒性有所下降。

圖4不同光照條件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

圖5不同振蕩條件對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

圖6不同接菌數(shù)量對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性的影響

2.2 西瓜炭疽病菌粗毒素生物活性測(cè)定結(jié)果

莖蔓針刺接種測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，西瓜炭疽病菌粗毒素接種到有針刺傷口的西瓜莖蔓后，可致西瓜莖蔓產(chǎn)生長(zhǎng)條形或梭形斑，邊緣褐色至深褐色，中部顏色較淺，病斑明顯凹陷（圖7），而對(duì)照則無(wú)癥狀出現(xiàn)。由此表明，病菌粗毒素對(duì)莖蔓有致病作用。其結(jié)果為毒素是西瓜炭疽病菌侵染過(guò)程中的主要致病因子提供了佐證。

圖7西瓜炭疽病菌粗毒素處理后莖蔓癥狀

幼苗浸漬致萎測(cè)定法表明，西瓜炭疽病菌粗毒素可對(duì)西瓜幼苗產(chǎn)生明顯的毒害作用。粗毒素處理24 h后，西瓜幼苗葉片開(kāi)始卷曲萎蔫，36 h后經(jīng)粗毒素處理的西瓜幼苗完全脫水萎蔫致死。而空白培養(yǎng)液對(duì)照的西瓜幼苗無(wú)萎蔫致死現(xiàn)象（圖8）。

圖8西瓜炭疽病菌粗毒素處理后幼苗萎蔫

種子胚根抑制法測(cè)定結(jié)果表明，西瓜種子在無(wú)菌水對(duì)照中正常生長(zhǎng)，胚根發(fā)育良好，在粗毒素處理中胚根生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，胚根生長(zhǎng)抑制率可達(dá)92.38%（圖9）。

圖9粗毒素對(duì)西瓜種子胚根生長(zhǎng)的抑制作用

種子萌發(fā)抑制法測(cè)定結(jié)果表明，西瓜種子在無(wú)菌水對(duì)照中萌發(fā)率良好，在粗毒素處理中萌發(fā)率受到嚴(yán)重抑制，種子萌發(fā)抑制率可達(dá)93.98%。

不同植物敏感性的測(cè)定結(jié)果表明，在10種供試植物中，西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆、草莓及山藥發(fā)病癥狀明顯，而茄子、辣椒、番茄均不發(fā)病，無(wú)病斑。該結(jié)果與采用菌餅和孢子懸浮液接種結(jié)果一致。

2.3 西瓜炭疽病菌粗毒素性質(zhì)的初步測(cè)定

2.3.1 西瓜炭疽病菌粗毒素的提純 試驗(yàn)結(jié)果表明，西瓜炭疽病菌粗毒素易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，不溶于乙酸乙酯、氯仿，由此推斷該類(lèi)毒素是一類(lèi)極性物質(zhì)。將初步純化的粗毒素蒸餾水回溶后處理西瓜莖蔓，96 h后即表現(xiàn)癥狀，對(duì)照無(wú)發(fā)病癥狀，證明初步純化的粗毒素具有活性，可產(chǎn)生致病作用。

2.3.2 西瓜炭疽病菌粗毒素原液中蛋白質(zhì)及非蛋白質(zhì)部分毒性測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)果表明，非蛋白質(zhì)組分處理西瓜莖蔓，96 h后即表現(xiàn)癥狀，胚根生長(zhǎng)抑制率為90.86%。而蛋白質(zhì)組分處理西瓜莖蔓后無(wú)發(fā)病癥狀且對(duì)胚根生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，初步推測(cè)該西瓜炭疽病菌粗毒素中起致病作用的是一種非蛋白質(zhì)。

2.3.3 熱處理對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素的影響 西瓜炭疽病菌粗毒素經(jīng)高溫（121 ℃）、高壓（0.103 MPa）處理20 min后毒性無(wú)顯著差異，胚根生長(zhǎng)抑制率為89.38%，說(shuō)明該西瓜炭疽病菌粗毒素的熱穩(wěn)定性較高。

2.3.4 西瓜炭疽病菌粗毒素濃度對(duì)毒性的影響 將西瓜炭疽病菌粗毒素按一定濃度稀釋后，其毒性發(fā)生明顯的變化，當(dāng)粗毒素稀釋為原濃度的10%、20%、33.3%、50%和100%時(shí)，胚根生長(zhǎng)抑制率分別為7.94%、27.32%、41.46%、64.94%、92.38%。即隨著濃度的增加其毒性增強(qiáng)，反之毒性降低。

3 結(jié)論與討論

病原真菌在寄主體外產(chǎn)毒量與培養(yǎng)條件的關(guān)系十分密切，并且有許多相關(guān)的研究報(bào)道。Richard培養(yǎng)液適宜水稻紋枯病菌和立枯絲核菌產(chǎn)毒（徐敬友 等，2004），本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。大多數(shù)真菌需培養(yǎng)10～20 d可達(dá)到最大產(chǎn)毒量（魯紹琴等，2006），有的真菌則需更長(zhǎng)時(shí)間（楊軍玉 等，2000），本試驗(yàn)中西瓜炭疽病菌的最佳產(chǎn)毒時(shí)間為20 d。在培養(yǎng)20 d后毒素產(chǎn)量反而有所下降，原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株生長(zhǎng)缺少營(yíng)養(yǎng)，故產(chǎn)毒量減少，還可能是由于積累其他代謝物質(zhì)而抑制了毒素的產(chǎn)生。萬(wàn)佐璽等（2001）確定了鏈格孢菌的最適產(chǎn)毒溫度為25 ℃，且大部分真菌的最佳產(chǎn)毒溫度均為25 ℃左右（彭建華 等，2009），與本試驗(yàn)所得結(jié)果基本吻合。蔣繼志等（2009）研究表明pH值為中性或接近中性環(huán)境最佳，例如適宜晚疫病粗毒素培養(yǎng)的條件為pH值 6～7（邢宇俊和程智慧，2006）。而有些嗜酸或嗜堿性病菌可能例外（葉茂 等，2001），本試驗(yàn)中西瓜炭疽病菌的產(chǎn)毒最佳pH值為6，與上述研究結(jié)果相似。至于光照的影響，則無(wú)明顯規(guī)律，有些真菌如大豆根腐病菌在光照條件下產(chǎn)毒量大（臺(tái)蓮梅和許艷麗，2004），有些真菌如大蒜白腐病菌則在黑暗條件下產(chǎn)毒量大（張林青和程智慧，2008），本試驗(yàn)中病菌在黑暗下產(chǎn)毒最多，可能因真菌種類(lèi)及生長(zhǎng)習(xí)性而異或光照有時(shí)易造成某種病菌的毒素分解。本試驗(yàn)中持續(xù)振蕩培養(yǎng)下產(chǎn)毒最多，可能因?yàn)橥饬枯^多，菌絲結(jié)團(tuán)成球。而在靜置條件下病菌在培養(yǎng)液表面形成厚厚的菌絲，且覆蓋住孢子，通氣量較少，故產(chǎn)毒量較少（李永燦 等，2013）。本試驗(yàn)中接菌數(shù)量從1塊到5塊增加，產(chǎn)毒量隨之上升，當(dāng)接菌數(shù)量為5塊時(shí)西瓜炭疽病菌粗毒素毒性達(dá)到最高，但7塊時(shí)又有所降低，其原因可能是接菌數(shù)量太多導(dǎo)致培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，致使毒性有所下降。可見(jiàn)適宜的培養(yǎng)條件對(duì)毒素高產(chǎn)有較大影響。

不同植物對(duì)病菌毒素的敏感性不同（陸寧海等，2006），在供試的10種植物中，葫蘆科植物對(duì)西瓜炭疽病菌粗毒素比較敏感，草莓和山藥也可發(fā)病，但茄子、辣椒、番茄等3種茄科植物均不敏感，無(wú)發(fā)病癥狀。因此可以利用和茄科植物輪作倒茬來(lái)減輕西瓜炭疽病的為害，同時(shí)應(yīng)將西瓜與其他葫蘆科植物以及草莓、山藥等分散種植，避免植株間相互感染，加重病害的傳播蔓延。

本試驗(yàn)中，西瓜炭疽病菌可產(chǎn)生有致病力的毒素，可致西瓜莖蔓產(chǎn)生類(lèi)似于病原菌侵染形成的癥狀。該毒素經(jīng)高溫（121 ℃）、高壓（0.103 MPa）處理20 min后毒性基本沒(méi)有變化，可溶于水。該結(jié)果與劉慧和袁世斌（2002）報(bào)道的膠孢炭疽菌菟絲子專(zhuān)化型〔Colletotrichum gloeosporoides（Penz.） Sacc. f. sp. cuscutae Chang〕可產(chǎn)生有致病力且溶于水的毒素，粗毒素液熱穩(wěn)定性較高，經(jīng)100 ℃處理30 min后致病率無(wú)明顯下降的結(jié)果較為一致。與劉守安等（2007）報(bào)道的茶炭疽病菌（Gloeosporium theaesinensis Miyake）可產(chǎn)生有致病力的外毒素，引起葉片產(chǎn)生類(lèi)似病原菌侵染的癥狀，熱穩(wěn)定性較高，是一種易溶于水的非蛋白類(lèi)物質(zhì)的結(jié)果相吻合。與歐陽(yáng)豐等（1993）報(bào)道的辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici Butler et Bisby）中可純化出一種多聚糖類(lèi)毒素，熱穩(wěn)定性較高，高溫蒸煮不改變其活性，毒素能使辣椒幼苗致萎，葉片受到毒害形成的壞死斑類(lèi)似于病菌侵染形成的癥狀的結(jié)果相符合。與王敬文（1986）報(bào)道的油茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae Massee）毒素是一種溶于水的大分子物質(zhì)，熱穩(wěn)定性高的結(jié)果較為相似。本試驗(yàn)初步推測(cè)西瓜炭疽病菌粗毒素中起致病作用的是一種非蛋白質(zhì)物質(zhì)，該結(jié)果與曲玲和曹有龍（2004）報(bào)道的枸杞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporoides Penz.）產(chǎn)生的毒素中起致病作用的是一種蛋白聚糖類(lèi)物質(zhì)的結(jié)果不一致，至于具體組分及其理化性質(zhì)則有待于進(jìn)一步研究確定。

本試驗(yàn)首次針對(duì)西瓜炭疽病菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，探明了產(chǎn)毒的最佳條件，并進(jìn)行了粗毒素的生物活性及其理化性質(zhì)的初步測(cè)定，為進(jìn)一步深入研究毒素活性組分、致病機(jī)理及利用毒素進(jìn)行抗病品種篩選等后續(xù)相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。

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Toxin-producing Condition Optimization and Biological Activity Determination of Colletotrichum orbiculare

TANG Shuang-shuang1，LIU Zhi-heng1*，YU Zhao-ge1，ZHENG Chuan1，LI Jian-bing1，ZHAO Tingchang2

（1College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，Liaoning，China；2Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Toxin-producing condition optimization and determination of crude toxin biological activity and its physical，chemical properties were carried out on Colletotrichum orbiculare. The results showed that different culture conditions had different influences on pathogenic toxin activity. The Richard culture medium with pH 6 ，culture temperature at 25℃，in dark，and shaking continuously for 20 d were the best toxin-producing conditions. The watermelon stem inoculated by crude toxin could produce the same acute symptom as the bacteria did，which had inhibitory effect on seed radicle growth and seed germination； and also a collapsing role on seedling. That toxin is the main pathogenic factor in the process of watermelon anthrax bacteria infection. Among the 10 kinds of selected plants inoculated by crude toxin，the symptoms of muskmelon，summer squash and strawberry were significant，while no symptoms were seen on tomato，eggplant and pepper.

Colletotrichum orbiculare； Crude toxin； Biological activity； Physical and chemical property

唐爽爽，女，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究，E-mail：805141919@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：劉志恒，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病理學(xué)、真菌學(xué)等教學(xué)與研究工作，E-mail：lzhh1954@163.com

2013-10-30 ；接受日期：2014-03-03

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-26）