（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌712100）

番茄果實(shí)特異性LYC-B干擾載體的構(gòu)建及在不同顏色果實(shí)中的表達(dá)特異性驗(yàn)證

王巧麗 梁 燕*張振才 李 翠 李云洲 王玲慧

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌712100）

為了研究番茄LYC-B干擾對類胡蘿卜素合成主要酶和主要代謝產(chǎn)物的影響，構(gòu)建了果實(shí)特異性的番茄紅素β-環(huán)化酶LYC-B干擾載體，并驗(yàn)證了其在不同顏色番茄果實(shí)中的有效性。依據(jù)X13437.1擴(kuò)增番茄果實(shí)特異啟動子E8，構(gòu)建了果實(shí)特異性載體E8-pBI121，其在粉色、紅色、綠色和紫色的番茄果實(shí)中均能表達(dá)。依據(jù)X86452.1擴(kuò)增番茄LYC-B從61～861 bp 間長度為801 bp的片段LYC-B1和從 480～781 bp 間長度為302 bp的片段 LYC-B2，構(gòu)建了以CaMV 35S為啟動子的LYC-B干擾表達(dá)載體pBI121-B1B2，以E8替換CaMV 35S，構(gòu)建了果實(shí)特異性干擾載體E8-pBI121-B1B2。采用農(nóng)桿菌注射法分別侵染番茄葉片和果實(shí)，GUS染色顯示，pBI121-B1B2在葉片、果實(shí)和種子中均表達(dá)，E8-pBI121-B1B2只在果實(shí)和種子中表達(dá)。

番茄；類胡蘿卜素；E8啟動子；CaMV 35S啟動子；GUS染色

據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2010年全球番茄產(chǎn)量達(dá)14.1億t（Branth?me，2010）。隨著人們生活水平的提高，番茄的營養(yǎng)和保健作用越來越受到重視，其中最重要的一類功能物質(zhì)就是類胡蘿卜素（Fraser＆Bramley，2004）。

番茄類胡蘿卜素合成代謝途徑的研究已經(jīng)較為明晰（姜娜娜 等，2007；Cazzonelli＆Pogson，2010）。在番茄果實(shí)類胡蘿卜素代謝中有兩個關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)：一是八氫番茄紅素合成酶，作用于牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸，啟動類胡蘿卜素合成代謝；二是番茄紅素環(huán)化酶，作用于番茄紅素，啟動番茄紅素降解為含環(huán)和含氧的類胡蘿卜素。番茄體內(nèi)八氫番茄紅素合成酶由PSY1和PSY2編碼，PSY1在花和果實(shí)中特異性表達(dá)，PSY2本底水平表達(dá)（Ray et al.，1987；Bartley et al.，1992；Fraser et al.，1999；Giorio et al.，2008）。已有一系列試驗(yàn)研究了PSY1對類胡蘿卜素合成代謝基因表達(dá)和物質(zhì)積累的影響（Fraser et al.，2002，2007； Gady et al.，2012；Robertson et al.，2012；Fantini et al.，2013）。番茄紅素環(huán)化酶分別由LYC-B、 LYC-E和 CYC-B編碼，其中CYC-B只在花和果實(shí)中特異性表達(dá)（Dalal et al.，2010），LYC-B和LYC-E組成型表達(dá)，三者均在果實(shí)成熟時下調(diào)表達(dá)（Pecker et al.，1996；Ronen et al.，1999，2000）。在果實(shí)未成熟時，番茄果實(shí)中牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸沿著不同代謝途徑合成植醇、赤霉素、類胡蘿卜素和脫落酸等；當(dāng)果實(shí)開始轉(zhuǎn)色時，PSY1表達(dá)水平成倍增加，這時牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸主要合成類胡蘿卜素（Giuliano et al.，1993），同時番茄紅素環(huán)化酶基因表達(dá)下降，開始積累番茄紅素（Bramley，2002）。

番茄紅素環(huán)化酶的研究主要集中在兩個方面，一是抑制紅色或者粉色番茄中番茄紅素環(huán)化酶的表達(dá)，提高番茄紅素含量（萬群 等，2007；徐加新和梁燕，2009； 馬超 等，2010）；二是通過上調(diào)番茄紅素β-環(huán)化酶的表達(dá)，提高維生素A源物質(zhì)含量（Apel＆Bock，2009）。前人研究均側(cè)重于獲得番茄紅素或者維生素A源物質(zhì)含量較高的番茄，但關(guān)于番茄紅素β-環(huán)化酶干擾對整個類胡蘿卜素代謝影響的研究僅限于Rosati等（2000）的研究。Rosati等（2000）用番茄PDS的啟動子和擬南芥LYC-B構(gòu)建番茄紅素β-環(huán)化酶正義表達(dá)載體（OE）和反義表達(dá)載體（AS），測定了轉(zhuǎn)基因和對照Money Maker番茄中番茄紅素、β-胡蘿卜素含量和總的類胡蘿卜素含量及PSY1、PSY2、PDS、ZDS和LYC-B基因的表達(dá)水平。獲得的OE和AS轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)內(nèi)總的類胡蘿卜素含量均增加；5個OE轉(zhuǎn)基因系OE1～OE5的β-胡蘿卜素含量與番茄紅素含量的比值均增加，6個AS轉(zhuǎn)基因系A(chǔ)S1～AS6的β-胡蘿卜素含量與番茄紅素含量的比值均下降。OE1～OE4果實(shí)PSY1、PSY2、PDS基因表達(dá)水平上升，而ZDS和LYC-B（除OE1外）基因表達(dá)水平下降；4個AS系（只測了AS3～AS6）中AS5和AS6中基因表達(dá)變化同OE系，AS3和AS4中這些基因表達(dá)水平均下降。

由于未知原因，Rosati等（2000）獲得的OE系其基因表達(dá)水平和AS系有某些相似之處，即PSY1、PSY2、PDS基因表達(dá)水平上升，而ZDS和LYC-B基因表達(dá)水平下降，這與OE和AS系中色素含量的不同有矛盾之處。由于當(dāng)時色素測量技術(shù)的局限性，Rosati等只測了番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量，無法將基因表達(dá)和色素積累對應(yīng)起來。隨著高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展，C30反相柱性能的改良，類胡蘿卜素代謝上所有中間產(chǎn)物的測定均成為可能（Fraser et al.，2007；Fantini et al.，2013）。番茄以果實(shí)為產(chǎn)品器官，因此本試驗(yàn)擬構(gòu)建在番茄果實(shí)特異性E8啟動子下的番茄LYC-B干擾載體，沿著前人基礎(chǔ)深入研究LYC-B干擾對類胡蘿卜素代謝主要酶和代謝物質(zhì)的具體影響。

近年來的研究表明不同顏色果實(shí)中所含的色素不同（孟凡娟 等，2006；曲瑞芳 等，2006；王蕾等，2011；趙潤洲和劉鳴韜，2011）。紅色和粉色番茄果實(shí)中含有大量番茄紅素和少量的β-胡蘿卜素。綠色番茄果實(shí)中僅含有少量β-胡蘿卜素和葉黃素，但含有大量葉綠素。紫色番茄果實(shí)中含較多番茄紅素和β-胡蘿卜素，同時含有大量葉綠素。黃色果實(shí)中以ζ-胡蘿卜素或β-胡蘿卜素為主。不同果實(shí)顏色與類胡蘿卜素代謝基因息息相關(guān)（金鳳媚 等，2006），利用不同顏色果實(shí)一起進(jìn)行研究，更能明確LYC-B干擾對類胡蘿卜素代謝可能具有的正向或者反向調(diào)控位點(diǎn)。本試驗(yàn)以紅色、粉色、黃色、綠色和紫色的番茄果實(shí)為材料，擬構(gòu)建番茄果實(shí)特異性E8啟動子啟動的LYC-B干擾表達(dá)載體，并通過GUS報(bào)告基因?qū)ζ湓诓煌压麑?shí)中的表達(dá)進(jìn)行載體有效性驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料 S2、S3、S5及S77均為櫻桃番茄（Solanum lycopersicum L. var cerasiforme Alef.），果實(shí)成熟時顏色分別為粉色、紫色、綠色和紅色，由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)資源課題組提供。

試劑pMD?18-T Vector購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司，pBI121質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)由本課題組保存。Trizol試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pfu DNA聚合酶和dNTP購自上海生工生物工程公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；引物合成與測序由上海生工生物工程公司完成；DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司，抗生素和X-Gluc購于Amresco；其他常規(guī)試劑采用國產(chǎn)分析純。

1.2 載體構(gòu)建

1.2.1 番茄基因組DNA和RNA提取 采用CTAB法提取番茄基因組DNA。Trizol法提取總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈（吳江敏 等，2011）。

1.2.2 E8啟動子的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中櫻桃番茄的E8序列X13437.1設(shè)計(jì)引物如下：

上游引物 E8F：

5′ GAAGGAATTTCACGAAATCGGC 3′

下游引物 E8R：

5′ TCTTTTGCACTGTGAATGATTAG 3′

50 μL PCR反應(yīng)體系： 5 μL 10×pfu buffer，1 μL dNTP，2 μL E8F引物（10 μmol·L-1），2 μL E8R引物（10 μmol·L-1），模板DNA 2 μL（1 200 ng·μL-1），加雙蒸水至50 μL。 PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，47℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.3 LYC-B基因片段B1、B2的擴(kuò)增、克隆載體的構(gòu)建及測序 根據(jù)GenBank中X86452.1設(shè)計(jì)兩對特異性引物。其中P1F和P1R用于克隆從61～861 bp的LYC-B1片段，P2F 和P2R用于克隆從480～781 bp的LYC-B2片段，B1反向和B2正向連接能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

引物序列如下：

P1F 5′GGCGCGCCAGGACCCCATTTGAAGTT TTCTTG 3′，5′引入Asc I酶切位點(diǎn)

P1R 5′GTGCTCTTCCACTTCAGCCA 3′

P2F 5′GGCGCGCCCTATGGTGTTTGGGTGGA TG 3′，5′引入Asc I酶切位點(diǎn)

P2R 5′CTAGAGAAGCCAGTTGCATC 3′

B1片段PCR反應(yīng)50 μL體系：5 μL 10×pfu buffer，1 μL dNTP，2 μL P1F引物（10 μmol·L-1），2 μL P1R引物（10 μmol·L-1），cDNA 200 ng，加DEPC水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。B2片段PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件基本同上，但需要將引物改為P2F與P2R，退火溫度為55 ℃，變性退火及延伸時間均為30 s。

克隆載體的構(gòu)建及測序參考姜娜娜等（2007）的方法。

1.2.4 果實(shí)特異性干擾載體構(gòu)建 質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系及條件參考Fermentas酶切體系說明（單酶切http：//www.thermoscientificbio.com/restriction-andmodifying-enzymes/restriction-enzymes/conventional，雙酶切http：//www.thermoscientificbio.com/webtools/ doubledigest/）。載體構(gòu)建過程參考徐加新和梁燕（2009）的方法。

1.2.5 載體的酶切驗(yàn)證 構(gòu)建的載體采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在含有50 μg·mL-1Kan、50 μg·mL-1Gen和10 μg·mL-1Rif的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)2 d。挑選陽性克隆在含有50 μg·mL-1Kan、50 μg·mL-1Gen和10 μg·mL-1Rif的LB液體培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，菌液PCR驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.3 載體在不同果色番茄中瞬時表達(dá)驗(yàn)證

將陽性克隆菌液搖至OD600在0.4～0.6之間，4 000 r·min-1離心5 min，用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，在28 ℃ 50 r·min-1的搖床上暗培養(yǎng)3 h，用懸浮液注射番茄活體果實(shí)和葉片。

活體果實(shí)注射：塑料大棚內(nèi)選取轉(zhuǎn)色期番茄果實(shí)，用1 mL注射器吸取菌液，沿著果頂垂直插入果實(shí)中軸中，緩緩注入菌液至菌液沿著果實(shí)萼片交界處溢出為止（約0.5 mL）。7 d后采果，用打孔器垂直橫穿果實(shí)中部取樣，用小刀將長圓柱形樣品切成短圓柱形，進(jìn)行GUS染色。

活體葉片注射：塑料大棚內(nèi)選取番茄中上部約5 cm長的小葉片，一手持載玻片，將葉片中部正面朝下平鋪在載玻片上，在葉片背面用1 mL注射器針頭沿主葉脈扎1個小孔，去掉注射器針頭，從小孔處注入菌液，菌液注入后葉片顏色比未注射的葉片顏色明顯變深，呈現(xiàn)暗綠色。7 d后用打孔器取樣，進(jìn)行GUS染色。

GUS染色參考吳江敏等（2011）的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 E8，LYC-B1，LYC-B2的克隆

以番茄基因組DNA為模板，用根據(jù)GenBank中X13437.1設(shè)計(jì)的引物E8F和E8R，PCR擴(kuò)增得到長度為1 181 bp的番茄果實(shí)特異性啟動子E8目的片段。以番茄cDNA為模板，用根據(jù)X86452.1設(shè)計(jì)的兩對特異引物P1F、P1R和P2F、P2R，擴(kuò)增得番茄LYC-B從61～861 bp 間長度為801 bp的片段即LYC-B1和從 480～781 bp 間長度為302 bp的片段即 LYC-B2。將上述3個片段分別與pMD?18-T載體連接，挑選陽性克隆，搖菌測序。測序結(jié)果顯示，E8與X13437.1相似度為99%，PLANCE分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增得到的E8序列與X13437.1相比，少了7個重復(fù)元件（表1），多了8個新元件（表2）。LYC-B1和LYC-B2與X86452.1相應(yīng)序列100%相同。后續(xù)可以用連接好的質(zhì)粒pMD-E8、pMD-B1和pMD-B2來構(gòu)建番茄果實(shí)特異性干擾表達(dá)載體。

2.2 CaMV 35S啟動子載體pBI121-B1B2的構(gòu)建

用Asc I和BamH I雙酶切pMD-LYC-B1（圖1），用Asc I和Sma I雙酶切pMD-LYC-B2（圖2），分別回收818 bp（808 bp的目的片段和少量載體序列）和325 bp（302 bp的目的片段和部分載體序列）片段。兩片段有一端均為Asc I酶切末端，在T4連接酶作用下，實(shí)現(xiàn)B1反向B2正向連接，回收約1 140 bp的連接片段（圖3）。用BamH I和Sma I雙酶切pBI121，回收大片段，與B1B2連接產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆，酶切驗(yàn)證插入了目的片段（圖4），即為pBI121-B1B2。

表1 X13437.1與克隆E8的序列元件比較

表2克隆的E8序列上出現(xiàn)的新元件

2.3 E8果實(shí)特異性啟動子表達(dá)載體E8-pBI121-B1B2的構(gòu)建

用HindⅢ和Xba I雙酶切pMD-E8（圖5），回收1148 bp片段，用HindⅢ和Xba I雙酶切pBI121回收13 893 bp片段，兩回收片段以質(zhì)量比約為1∶1進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒用HindⅢ和Xba I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，顯示E8已經(jīng)取代CaMV 35S插入pBI121啟動子區(qū)，該質(zhì)粒即為E8-pBI121（圖6）。E8-pBI121和pBI121-B1B2分別用BamH I進(jìn)行單酶切，并以質(zhì)量比約為1∶1進(jìn)行連接，酶切驗(yàn)證質(zhì)粒獲得番茄LYC-B果實(shí)特異性干擾載體E8-pBI121-B1B2（圖7）。

2.4 E8-pBI121、pBI121-B1B2和E8-pBI121-B1B2在番茄不同顏色果實(shí)中的表達(dá)

E8-pBI121、pBI121-B1B2和E8-pBI121-B1B2分別通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用陽性菌落搖菌，制備農(nóng)桿菌注射液，分別對番茄材料進(jìn)行葉片和果實(shí)注射，并對注射后的葉片和果實(shí)進(jìn)行GUS染色，見圖8和圖9。

圖1 pMD-LYC-B1質(zhì)粒Asc I和BamH I雙酶切譜圖

圖2 pMD-LYC-B2質(zhì)粒Asc I和Sma I雙酶切圖譜

圖3 LYC-B1、LYC-B2和B1B2連接回收產(chǎn)物

圖4 pBI121-B1B2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖及酶切驗(yàn)證

圖5 pMD-E8質(zhì)粒HindⅢ和Xba I雙酶切圖譜

圖6 E8-pBI121質(zhì)粒Hin dⅢ和Xba I雙酶切驗(yàn)證

圖7 E8-pBI121-B1B2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖和酶切驗(yàn)證

由圖8可以看出，用含E8-pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液注射S2（粉色）、S3（紫色）、S5（綠色）、S77（紅色）4種不同顏色番茄果實(shí)后，果肉中GUS染色顏色都呈現(xiàn)藍(lán)色，而未經(jīng)過注射的對照果實(shí)果肉沒有藍(lán)色呈現(xiàn)，說明本試驗(yàn)所克隆的E8在這4個材料果實(shí)中均有表達(dá)，可以作為番茄果實(shí)特異性啟動子使用。

由圖9可以看出，以CaMV 35S為啟動子的pBI121-B1B2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液注射的S77（紅色），GUS染色后葉片、果皮、果肉、種子和種皮被毛均呈現(xiàn)藍(lán)色（圖9），而未經(jīng)pBI121-B1B2侵染的對照相應(yīng)的各個器官均無藍(lán)色呈現(xiàn)，說明以CaMV 35S作為啟動子的pBI121-B1B2中GUS在植株的葉片、果實(shí)、種子均能表達(dá)。E8-pBI121-B1B2在S77果實(shí)瞬時表達(dá)后，GUS染色結(jié)果為果皮、果肉、種子和種皮被毛均被染色成藍(lán)色，與pBI121-B1B2不同的是葉片沒有呈現(xiàn)藍(lán)色，再次驗(yàn)證了本試驗(yàn)中克隆的E8為果實(shí)特異性啟動子。在S2、S3和S5中有相同的GUS染色結(jié)果。

圖8和圖9呈現(xiàn)的結(jié)果共同證明所構(gòu)建E8-pBI121-B1B2果實(shí)特異性表達(dá)載體的有效性和果實(shí)特異性。載體E8-pBI121-B1B2可以用于研究LYC-B干擾對番茄不同顏色果實(shí)中類胡蘿卜素代謝的具體影響。

圖8 E8-pBI121瞬時表達(dá)于不同顏色番茄材料果實(shí)的GUS染色結(jié)果

圖9 pBI121-B1B2和E8-pBI121-B1B2瞬時表達(dá)于S77不同部位的GUS染色結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)所用載體為pBI121，以CaMV 35S為啟動子。CaMV 35S啟動子是雙子葉植物表達(dá)載體中廣泛使用的組成型啟動子，其可驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植株的所有部位和發(fā)育階段持續(xù)表達(dá)，使植物體內(nèi)有限的資源在無用的組織和發(fā)育階段中浪費(fèi)，造成植株不正常生長。如CaMV 35S驅(qū)動PSY1過表達(dá)致使植株體內(nèi)赤霉素含量過少，植株出現(xiàn)矮化，不能正常發(fā)育（Fray et al.，1995）。周曉紅等（2004）把CaMV 35S改造為E35S使其有更強(qiáng)的組成型啟動子功能，3株轉(zhuǎn)基因番茄在同等的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選誘導(dǎo)成苗，同步進(jìn)行栽種，有2株果實(shí)形態(tài)偏離了正常，呈現(xiàn)小棉桃型。為避免組成型啟動子造成的類似弊端，加之番茄以果實(shí)作為主要食用器官和商品器官，所以本試驗(yàn)采用了果實(shí)特異性的啟動子。番茄果實(shí)特異性啟動子有PSY1、CYC-B、PDS（Corona et al.，1996）、E8（Deikman＆Fischer，1988，1992）、PG（Nicholass et al.，1995）等基因的啟動子。以往研究發(fā)現(xiàn)PDS啟動子上可能存在著與其他類胡蘿卜素基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的反式作用因子（Rosati et al.，2000）。本試驗(yàn)研究的是番茄果實(shí)類胡蘿卜素代謝，選用了E8啟動子。

Zhao等（2009）從7個番茄亞種共16個材料中分別克隆了E8啟動子，發(fā)現(xiàn)E8啟動子序列長度從2 101 bp到2 256 bp不等，序列相似性為69.9%。Deikman和Fischer（1988）及Deikman等（1992）對一個全長為2 181 bp的E8的啟動子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)E8有兩個組成部分：第一部分是從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到-1 088處的 “核心區(qū)域”，在果實(shí)成熟時啟動特異性轉(zhuǎn)錄；第二部分則是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-1 088到-2 181處的 “輔助區(qū)域”，含有乙烯反應(yīng)性的轉(zhuǎn)錄元件，能夠增強(qiáng)E8啟動子的轉(zhuǎn)錄效率。只要有“核心區(qū)域”E8就能在果實(shí)中表達(dá)。本試驗(yàn)依據(jù)櫻桃番茄E8啟動子（GenBank ID X13437.1）克隆了約1.1 kb E8序列，測序顯示兩者同源性為99%。GUS染色結(jié)果表明，CaMV 35S啟動子在葉片和果實(shí)中均表達(dá)，而E8只在果實(shí)中表達(dá)，與已有的研究結(jié)果一致（周曉紅，2004；丁淑麗 等，2006；Kesanakurti et al.，2012），證明了本試驗(yàn)所構(gòu)建的番茄果實(shí)特異性干擾載體E8-pBI121-B1B2的有效性。

本課題組現(xiàn)擁有不同果實(shí)顏色的番茄材料，E8-pBI121-B1B2在不同果色番茄中均有果實(shí)特異性，這對于番茄類胡蘿卜素代謝的研究提供了方便，本試驗(yàn)構(gòu)建的載體對不同果實(shí)顏色番茄進(jìn)行轉(zhuǎn)化為揭示番茄紅素β-環(huán)化酶對類胡蘿卜素代謝酶和物質(zhì)的具體影響及調(diào)控位點(diǎn)做了一個鋪墊。

丁淑麗，李建勇，鄒宜靜，盧鋼，曹家樹．2006．酵母SAMDC基因表達(dá)載體構(gòu)建以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄的研究．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，32（6）：621-627．

姜娜娜，李長生，王絳輝，畢玉平，王興軍．2007．番茄類胡蘿卜素的研究．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（34）：10979-10980．

金鳳媚，薛俊，郟艷紅，劉仲齊．2006．番茄果實(shí)顏色相關(guān)基因的研究進(jìn)展．天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，12（4）：3-6．

馬超，何娟，郝青南，王蕾，魯曉燕，馬兵鋼．2010．構(gòu)建番茄紅素β/ε環(huán)化酶基因RNAi植物表達(dá)載體及其表達(dá)分析．核農(nóng)學(xué)報(bào)，24（3）：482-489．

孟凡娟，許向陽，李景富．2006．番茄果實(shí)色素含量和表面顏色相關(guān)性研究．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，37（4）：459-462．

曲瑞芳，梁燕，鞏振輝，楊永政．2006．番茄不同品種間番茄紅素含量變化規(guī)律的研究．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，15（3）：121-123．

萬群，張興國，宋明．2007．果實(shí)特異性RNAi介導(dǎo)的基因沉默來增加番茄中番茄紅素的含量．生物工程學(xué)報(bào)，23（3）：429-433．

王蕾，岳英，魯曉燕，馬兵鋼．2011．不同色澤番茄品種類胡蘿卜素含量的HPLC分析．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，29（4）：442-447．

吳江敏，孫亞東，梁燕，徐加新．2011．番茄紅素-β-環(huán)化酶（LYC-b）反義基因在番茄轉(zhuǎn)基因后代的表達(dá)及其遺傳穩(wěn)定性．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，19（5）：801-807．

徐加新，梁燕．2009．LYC-b基因反義表達(dá)對番茄果實(shí)番茄紅素含量的影響．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，37（12）：127-132．

趙潤洲，劉鳴韜．2011．番茄果實(shí)色澤與色素組成的關(guān)系．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（9）：98-100．

周曉紅．2004．弓形蟲MAG和tSAG1在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)研究〔博士論文〕．廣州：第一軍醫(yī)大學(xué)．

Apel W，Bock R．2009．Enhancement of carotenoid biosynthesis in transplastomic tomatoes by induced lycopene-to-provitamin A conversion．Plant Physiol，151（1）：59-66．

Bartley G E，Viitanen P V，Bacot K O，Scolnik P A．1992．A tomato gene expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway．Journal of Biological Chemistry，267（8）：5036-5039．

Bramley P M．2002．Regulation of carotenoid formation during tomato fruit ripening and development．Journal of Experimental Botany，53（377）：2107-2113．

Branth?me F X．2010．Trends in tomato products consumption compared to total tomato consumption city．（http：//www．chilealimentos．com/medios/Servicios/noticiero/EstudioMercadoCoyuntura2011/ Conservas/Fresh_vs_processed_tomato_consumption_study_ January_2011.pdf．）

Cazzonelli C I，Pogson B J．2010．Source to sink：regulation of carotenoid biosynthesis in plants．Trends Plant Sci，15（5）：266-274．

Corona V，Aracri B，Kosturkova G，Bartley G E，Pitto L，Giorgetti L，Scolnik P A，Giuliano G．1996．Regulation of a carotenoid biosynthesis gene promoter during plant development．The Plant Journal，9（4）：505-512．

Dalal M，Chinnusamy V，Bansal K C．2010．Isolation and functional characterization of lycopene β-cyclase（CYC-B） promoter from Solanum habrochaites．BMC Plant Biology，10（1）：1-15．

Deikman J，F(xiàn)ischer R L．1988．Interaction of a DNA binding factor with the 5′-flanking region of an ethylene-responsive fruit ripening gene from tomato．EMBO J，7（11）：3315-3320．

Deikman J，Kline R，F(xiàn)ischer R L．1992．Organization of ripening and ethylene regulatory regions in a fruit-specific promoter from tomato（Lycopersicon esculentum）．Plant Physiology，100（4）：2013-2017．

Fantini E，F(xiàn)alcone G，F(xiàn)rusciante S，Giliberto L，Giuliano G．2013．Dissection of tomato lycopene biosynthesis through virus-induced gene silencing．Plant Physiology，163（2）：986-998．

Fraser P D，Bramley P M．2004．The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids．Progress in Lipid Research，43（3）：228-265．

Fraser P D，Kiano J W，Truesdale M R，Schuch W，Bramley P M．1999．Phytoene synthase-2 enzyme activity in tomato does not contribute to carotenoid synthesis in ripening fruit．Plant Molecular Biology，40：687-698．

Fraser P D，Romer S，Shipton C A，Mills P B，Kiano J W，Misawa N，Drake R G，Schuch W，Bramley P M．2002．Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner．Proceedings of the National Academy of Sciences，99（2）：1092-1097．

Fraser P D，Enfissi E M A，Halket J M，Truesdale M R，Yu D ，Gerrish C，Bramley P M．2007．Manipulation of phytoene levels in tomato fruit：effects on isoprenoids，plastids，and intermediary metabolism．Plant Cell，19（10）：3194-3211．

Fray R G，Wallace A，F(xiàn)raser P D，Valero D，Hedden P，Bramley P M，Grierson D．1995．Constitutive expression of a fruit phytoene synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolites from the gibberellin pathway．The Plant Journal，8（5）：693-701．

Gady A L F，Vriezen W H，Mhbj V d W，Huang P P，Bovy A G，Visser R G F，Bachem C W B．2012．Induced point mutations in the phytoene synthase 1 gene cause differences in carotenoid content during tomato fruit ripening．Molecular Breeding，29（3）：801-812．

Giorio G，Stigliani A L，D' Ambrosio C．2008．Phytoene synthase genes in tomato（Solanum lycopersicum L．） -new data on the structures，the deduced amino acid sequences and the expression patterns．Febs Journal，275（3）：527-535．

Giuliano G，Bartley G E，Scolnik P A．1993．Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato development．Plant Cell，5（4）：379-387．

Kesanakurti D，Kolattukudy P E，Kirti P B．2012．Fruit-specific overexpression of wound-induced tap1 under E8 promoter in tomato confers resistance to fungal pathogens at ripening stage．Physiologia Plantarum，146（2）：136-148．

Nicholass F，Smith C S，Schuch W，Bird C，Grierson D．1995．High levels of ripening-specific reporter gene expression directed by tomato fruit polygalacturonase gene-flanking regions．Plant Molecular Biology，28（3）：423-435．

Pecker I，Gabbay R，Cunningham F X．1996．Cloning and characterization of the cDNA for lycopene beta-cyclase from tomato reveals declease in its expression during fruit ripening．Plant Mol Biol，30（4）：807-819．

Ray J，Bird C，Maunders M，Grierson D，Schuch W．1987．Sequence of pTOM5，a ripening related cDNA from tomato．Nucleic Acids Research，15（24）：10587．

Robertson F P，Kaisa K P，Christopher G，Halket J M，Patel R K P，F(xiàn)raser P D，Bramley P M．2012．Proteome changes in tomato lines transformed with phytoene synthase-1 in the sense and antisense orientations．Journal of Experimental Botany，63（16）：6035-6043．

Ronen G，Cohen M，Zamir D，Hirschberg J．1999．Regulation ofcarotenoid biosynthesis during tomato fruit development：expression of the gene for lycopene epsilon cyclase is down regulated during ripening and is elevated in the mutant delta．Plant Journal，1（7）：341-351．

Ronen G，Carmel-Goren L，Zamir D，Hirschberg J．2000．An alternative pathway to β-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of Beta and old-gold color mutations in tomato．Proceedings of National Academy of Sciences，97：11102-11107．

Rosati C，Aquilani R，Dharmapuri S，Pallara P，Marusic C，Tavazza R，Bouvier F，Camara B，Giuliano G．2000．Metabolic engineering of beta-caroteneand lycopene content tomato fruit．Plant Journal，24（3）：413-419．

Zhao Lingxia，Lu Liya，Zhang Lida，Wang Aoxue，Wang Ning，Liang Zhuobin，Lu Xiaowen，Tang Kexuan．2009．Molecular evolution of the E8 promoter in tomato and some of its relative wild species．Journal of Biosciences，34（1）：71-83．

Construction of Cherry Tomato Fruit Specific LYC-B Interference Vector and Validation of Its Specific Expression in Fruits of Discrepant Colors

WANG Qiao-li，LIANG Yan*，ZHANG Zhen-cai，LI Cui，LI Yun-zhou，WANG Ling-hui

（College of Horticulture，Northwest Agriculture & Forestry University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

The experiment will be conducted to research the specific impacts of lycopene β-cyclase interference on carotenoid metabolism，cherry tomato（Solanum lycopersicum L. var. cerasiforme Alef.） fruitspecific lycopene β-cyclase interference vector was constructed，and the validity in different color fruits were verified. Cherry tomato fruit-specific promoter E8 was amplified according to X13437.1 and fruit-specific vector of E8-pBI121 was constructed，which could be expressed in cherry tomato fruits of pink，red，green and purple colors. According to X86452.1，two different lycopene β-cyclase sequences B1 and B2 were amplified，LYC-B1 with 801 bp from 61 bp to 861 bp and LYC-B2 with 302 bp from 480 bp to 781 bp of LYC-B. The interference vector of pBI121-B1B2 with CaMV 35S promotor and the fruit-specific expression interference vectors of E8- pBI121-B1B2 with E8 promotor were constructed. E8-pBI121，pBI121-B1B2 and E8-pBI121-B1B2 were transferred into Agrobacterium tumefaciens GV3101 with the freeze-thaw method，then transformed into living cherry tomato fruits and leaves by injection. The results of GUS staining 7 days after injection showed that E8-pBI121 expressed in pink，red，green and purple cherry tomato fruits；pBI121-B1B2 expressed in leaves，fruits and seeds，while E8- pBI121-B1B2 expressed just in fruits and seeds.

Cherry tomato；Carotenoid；E8 promoter；CaMV 35S promoter；GUS

王巧麗，女，碩士研究生，主要從事番茄遺傳育種研究工作，E-mail：wangql0704@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：梁燕，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事番茄新品種選育與蔬菜種質(zhì)資源創(chuàng)新研究工作，E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn

2013-12-26；接受日期：2014-03-10

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2011KTCL02-03），西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)科技推廣基金項(xiàng)目（TGZX2012-02）