王璐，孫瓊，徐學(xué)凡，張燦

（中國藥科大學(xué)新藥研究中心，江蘇 南京210009）

·藥學(xué)研究·
PHARMACEUTICAL RESEARCH

一種新型還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)的合成及其在模擬細胞質(zhì)還原性環(huán)境中的降解動力學(xué)

王璐，孫瓊，徐學(xué)凡，張燦*

（中國藥科大學(xué)新藥研究中心，江蘇 南京210009）

目的：設(shè)計合成一種新型還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)材料，以期由其制得的脂質(zhì)體可用作核酸藥物載體在細胞質(zhì)還原性環(huán)境促發(fā)下降解而釋放藥物。方法：以胱胺為原料引入二硫鍵，合成還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)材料H-SS-E2C14，并用其制備還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)體H-SS-E2C14-L；同時，以半胱胺為原料合成H-SS-E2C14的降解產(chǎn)物CS-E2C14，且采用HPLC法定量考察H-SS-E2C14在模擬細胞質(zhì)還原性環(huán)境中的降解動力學(xué)。結(jié)果：合成的H-SS-E2C14在模擬細胞質(zhì)還原性環(huán)境中的24 h累積降解率約為70%。結(jié)論：H-SS-E2C14-L有望成為一種理想的基因藥物載體。

還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)；合成；核酸藥物載體；二硫鍵；降解動力學(xué)

近年來，在核酸藥物胞內(nèi)遞送系統(tǒng)的研究中，用作藥物載體的還原敏感型脂質(zhì)體受到極大關(guān)注。與傳統(tǒng)脂質(zhì)體相比，還原敏感型脂質(zhì)體的特點是結(jié)構(gòu)中引入了對還原性環(huán)境敏感的二硫鍵，作為藥物載體其具有毒性低、促進藥物胞內(nèi)釋放和提高藥物生物利用度的優(yōu)點，并能顯著提高核酸藥物的轉(zhuǎn)染效率，故有望成為核酸藥物胞內(nèi)遞送的理想載體[1]。在細胞質(zhì)中，主要的還原性物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）的濃度約為0.5～10 mmol·L-1，而在細胞外，其濃度約為2～20 μmol·L-1，二者相差3個數(shù)量級，致使細胞內(nèi)外存在著巨大的還原勢能梯度[2]。因此，結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵的還原敏感型脂質(zhì)體在細胞外能保持穩(wěn)定，而進入細胞質(zhì)的還原性環(huán)境中后，則易發(fā)生由還原型分子尤其是GSH介導(dǎo)的巰基-二硫鍵交換反應(yīng)而迅速降解，從而促使所載核酸藥物從脂質(zhì)體中迅速釋放出來[3]。

本文設(shè)計合成了一種新型還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)材料2-(3,12-二氧代-2-((1H-咪唑-4-基)甲基)-,8-二硫-1,4,11-三氮雜十五烷基)戊二酸雙十四醇二酯二鹽酸鹽（H-SS-E2C14），還合成了其降解產(chǎn)物2-(4-(2-巰基乙基)氨基-4-氧代丁酰胺基)戊二酸雙十四醇二酯（CS-E2C14），并將H-SS-E2C14與大豆磷脂S100（PC）和膽固醇（Chol）混合制得還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)體（H-SS-E2C14-L），且考察了該脂質(zhì)材料在模擬胞質(zhì)還原性環(huán)境中的降解動力學(xué)。

1 試劑與儀器

胱胺二鹽酸鹽（AED，純度99%，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；N-叔丁氧羰基-N(咪唑)-(4-甲基苯磺?；?-L-組氨酸[Boc-L-His (Tos)-OH，純度98%，吉爾生化有限公司]；半胱胺鹽酸鹽（CS，純度99%，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；大豆磷脂S100（PC，上海東尚實業(yè)有限公司）；膽固醇（Chol，上?；菖d生化試劑有限公司）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes，上海阿拉丁試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

圖1 H-SS-E2C14的合成路線Figure 1 Synthetic route of H-SS-E2C14

BS110S型電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；ZetaPlus粒徑電位測定儀（美國Brookhaven Instruments公司）；JY92-IIN型超聲波細胞粉粹機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；NICOLET Impact 410型紅外光譜（IR）儀（KBr壓片或液膜，美國Nicolet公司）；BRUKER AV-300或AV-500型核磁共振（NMR）儀（內(nèi)標(biāo)為TMS，溶劑為CDCl3，德國Bruker公司）；LC-2010A型液相一體機（日本島津公司）；MAT95XP型高分辨質(zhì)譜（HRMS）儀（美國Thermo公司）。

2 方法及結(jié)果

2.1 H-SS-E2C14的合成

H-SS-E2C14的合成路線如圖1所示。

2-氨基戊二酸十四醇酯（1）的合成 將L-谷氨酸（2.9 g，19.7 mmol）和對甲苯磺酸（TsOH，2.22 g，11.7 mmol）溶于50 mL甲苯，回流1 h，加入正十四醇（5.0 g，23.3 mmol），回流12 h，減壓蒸餾去除甲苯；濃縮物用35 mL甲醇重結(jié)晶后，溶于適量二氯甲烷，用5%碳酸氫鈉水溶液洗滌（10 mL×2），再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得目標(biāo)產(chǎn)物白色粉末狀固體3.42 g（收率53.4%）。

1-(叔丁氧羰基)胱胺（2）的合成 將AED（3.0 g，13.3 mmol）溶于150 mL甲醇中，加入三乙胺（5.79 mL，39.9 mmol），室溫下滴加二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O，2.9 g，13.3 mmol]的甲醇溶液，室溫攪拌5 h；旋干反應(yīng)液，加入1 mol·L-1磷酸二氫鈉水溶液60 mL，用乙醚萃?。?0 mL×2），水層用1 mol·L-1氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至9，再用乙酸乙酯萃?。?0 mL×2），合并有機層，用水洗滌（60 mL×2），無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得目標(biāo)產(chǎn)物白色油狀物1.57 g（收率46.8%）。

1-(叔丁氧羰基)-8-(3-羧基丙?；?胱胺（3）的合成將化合物2（1.57 g，6.23 mmol）溶于80 mL二氯甲烷，加入丁二酸酐（Suc，0.62 g，6.23 mmol）和對二甲氨基吡啶（0.23 g，1.87 mmol）的二氯甲烷溶液（15 mL），室溫攪拌5 h；反應(yīng)液用1 mol·L-1硫酸氫鉀水溶液洗滌（50 mL×2），有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得目標(biāo)產(chǎn)物白色油狀物2.12 g（收率98.2%）。

2-(2,2-二甲基-4，13-二氧代-3-氧雜-8,9-二硫-5,12-二氮雜十六烷基酰胺)戊二酸雙十四醇二酯（4）的合成 將化合物3（2.12 g，6.0 mmol）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI，2.31 g，12.0 mmol）和1-羥基苯并三氮唑（HOBt，1.62 g，12.0 mmol）溶于80 mL氯仿，室溫攪拌3 h，加入化合物1（3.24 g，6.0 mmol）和三乙胺（3.36 mL，24.0 mmol）的氯仿溶液40 mL，室溫攪拌12 h；反應(yīng)液用水洗滌（80 mL×2），再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，所得白色固體經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫溶劑：二氯甲烷-甲醇（75:1）]純化，得目標(biāo)產(chǎn)物白色固體4.1 g（收率77.9%）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 4.57 (m, 1H, COCHNH), 4.12 (t, 2H, COOCH2, J=6.75 Hz), 4.06 (t, 2H, COOCH2, J=6.80 Hz), 3.56 (m, 2H, SCH2CH2), 3.43 (m, 2H, SCH2CH2), 2.80 (m, 4H, 2SCH2), 2.57 (m, 4H, COCH2, OCOCH2), 2.35 (m, 2H, COCH2), 2.19、1.99 (m, 2H, CHCH2), 1.62 (m, 4H, 2COOCH2CH2), 1.44 (s, 9H, COOC(CH3)3), 1.26 (m, 44H, 十四烷基中CH2), 0.88 (m, 6H, 2CH2CH3)。 HRMS (ESI+) m/z: C46H87N3NaO8S2[M+Na]+理論值896.5827, 實測值896.5845。 IR (KBr壓片) σ(cm-1): 3 363, 3 331, 2 919, 2 850, 1 732, 1 682, 1 649, 1 525, 1 468, 1 278, 1 192, 1 097, 966, 721, 632。

2-(9-氧代-4,5-二硫-1,8-二氮雜十二烷基酰胺)戊二酸雙十四醇二酯鹽酸鹽（5）的合成 將化合物4（4.1 g，4.7 mmol）溶于200 mL飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液（HCl/ EA），0℃攪拌12 h，過濾干燥，得目標(biāo)產(chǎn)物白色蠟狀固體3.3 g（收率86.8%）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 4.55 (m, 1H, COCHNH), 4.07 (m, 4H, 2COOCH2), 3.56 (m, 2H, SCH2CH2), 2.79 (m, 4H, 2SCH2), 2.54 (m, 4H, COCH2, SCH2CH2), 2.39 (m, 2H, COCH2), 1.97 (m, 2H, OCOCH2), 1.84 (m, 2H, CHCH2), 1.57 (m, 4H, 2COOCH2CH2), 1.24 (m, 44H, 十四烷基中CH2), 0.87 (m, 6H, 2CH2CH3)。HRMS (ESI+) m/z: C41H80N3O6S2[M+H]+理論值774.5483,實測值774.5492。IR (KBr壓片) σ(cm-1): 3 308, 2 961, 2 918, 2850, 1 739, 1 639, 1 537, 1 469, 1 420, 1 262, 1 199, 1 095, 1 021, 801, 719, 698。

2-(2,2-二甲基-4,7,16-三氧代-6-((1-對基苯磺?；?咪唑-4-基)甲基)-3-氧雜-11,12-二硫-5,8,15-三氮雜十九烷基)戊二酸雙十四醇二酯（6）的合成 將Boc-L-His(Tos)-OH（0.81 g，2.0 mmol）、EDCI（0.76 g，4.0 mmol）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS，0.45 g，4.0 mmol）溶于40 mL氯仿，室溫攪拌3 h，加入化合物5（1.6 g，2.0 mmol）和三乙胺（1.1 mL，8.7 mmol）的氯仿溶液20 mL，室溫攪拌12 h；反應(yīng)液用水洗滌（50 mL×2），再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，所得白色固體經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫溶劑：二氯甲烷-甲醇（60:1）]純化，得目標(biāo)產(chǎn)物白色固體1.7 g（收率 74.1%）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.94 (s, 1H, N=CH), 7.35-7.83 (m, 4H, ArH), 7.14 (s, 1H, CH2C=CH), 4.58 (m, 1H, COCHNH), 4.46 (m, 1H, COCHNH), 4.08 (m, 4H, 2COOCH2), 3.49 (m, 4H, 2SCH2CH2), 3.00 (m, 2H, CHCH2), 2.81 (m, 4H, CH2SSCH2), 2.59 (m, 2H, COCH2), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.38 (m, 2H, OCOCH2), 2.18 (m, 2H, COCH2), 1.95 (m, 2H, CHCH2), 1.60 (m, 4H, 2COOCH2CH2), 1.41 (m, 9H, C(CH3)3), 1.26 (m, 44H, 十四烷基中CH2), 0.88 (m, 6H, 2CH2CH3)。MS (ESI+) m/z: C59H100N6NaO11S3[M+Na]+理論值1 187.7, 實測值1 187.7。IR (KBr壓片) σ(cm-1):

3 314, 3 068, 2 921, 2 851, 1 734, 1 655, 1 530, 1 469, 1 380, 1 330, 1 248, 1 174, 1 093, 815, 721, 676, 592, 541。

2-(2,2- 二甲基-4,7,16- 三氧代-6-((1H- 咪唑-4- 基) 甲基)-3- 氧雜-11,12- 二硫-5,8,15- 三氮雜十九烷基) 戊二酸雙十四醇二酯（7）的合成 將化合物6（1.51 g，1.3 mmol）溶于40 mL 四氫呋喃，40℃攪拌下，加入HOBt（2.10 g，15.6 mmol），繼續(xù)攪拌5 h，蒸去溶劑，所得白色固體經(jīng)硅膠柱色譜[ 洗脫溶劑：二氯甲烷- 甲醇（35:1）] 純化，得目標(biāo)產(chǎn)物淡黃色蠟狀固體1.25 g（收率95.4%）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ : 7.98 (s, 1H , N=CH ), 7.64 (s, 1H , CH2C=CH ), 4.46 (m, 2H , 2COCH NH), 3.97 (m, 4H , 2COOCH2), 3.42 (m, 4H , 2SCH2CH2), 3.02 (m, 2H , CHCH2), 2.57 (m, 8H , COCH2, OCOCH2, CH 2SSCH2), 2.30 (m, 2H , COCH2), 1.87-2.12 (m, 2H , CHCH2), 1.52 (m, 4H , 2COOCH2CH2), 1.28 (m, 9H , C(CH3)3), 1.18 (m, 44H , 十四烷基中CH2), 0.80 (m, 6H , 2CH2CH3)。HRMS (ESI+) m /z : C52H95N6O9S2 [M+H]+ 理論值1 011.6596,實測值1 011.6602。IR (KBr 壓片) σ (cm-1): 3 315, 2 956, 2 919, 2 851, 1 733, 1 647, 1 529, 1 468, 1 397, 1 368, 1 331, 1 251, 1 194, 1 035, 816, 721, 684, 569。 H-SS-E2C14 的合成 將化合物7（1.25 g，1.2 mmol）溶于25 mL HCl/EA，0℃攪拌12 h，過濾，干燥，得目標(biāo)產(chǎn)物白色蠟狀固體0.96 g（收率78.7%）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ : 7.82 (s, 1H , N=CH ), 7.10 (s, 1H , CH2C=CH ), 4.56 (m, 1H , COCH NH), 4.09 (m, 4H , 2COOCH2), 3.54 (m, 5H , 2SCH2CH2, COCH NH2), 3.03 (m, 2H , CHCH2), 2.79 (m, 4H , 2SCH2), 2.60 (m, 4H , COCH2, OCOCH2), 2.40 (m, 2H , COCH2), 2.19、2.00 (m, 2H , CHCH2), 1.63 (m, 4H , 2COOCH2CH2), 1.27 (m, 44H , 十四烷基中CH2), 0.89 (m, 6H , 2CH2CH3)。HRMS (ESI+) m /z : C47H86N6NaO7S2[M+Na]+ 理論值933.5892, 實測值933.5910。IR (KBr 壓片) σ (cm-1): 3 245, 2 922, 2 852, 1 738, 1 677, 1 640, 1 560, 1 467, 1 365, 1 193, 1 082,1 034, 819, 721, 624。

2.2 CS-E2C14 的合成CS-E2C14 的合成路線如圖2 所示。

圖2 CS-E2C14的合成路線Figure 2 Synthetic route of CS-E2C14

2-(三苯甲基巰基)乙胺（8）的合成 將CS（1.00 g，8.8 mmol）及三苯甲醇（Ph3COH，2.2 g，8.5 mmol）溶于10 mL氯仿，加入三乙胺（1.4 mL，10.0 mmol），升溫至75℃，緩慢加入三氟化硼乙醚（3 mL)，回流4 h；旋干反應(yīng)液，加入15 mL甲醇，再蒸去大部分溶劑，攪拌下加入5%碳酸氫鈉水溶液，過濾，干燥，得目標(biāo)產(chǎn)物白色粉末狀固體2.60 g（收率96.7%）[4]。

4-氧代-4-((2-三苯甲基巰基)乙基氨基)丁酸（9）的合成 將化合物8（1.00 g，3.1 mmol）溶于40 mL氯仿和5 mL 四氫呋喃的混合溶劑，室溫攪拌下，加入Suc（0.31g，3.1 mmol）和對二甲氨基吡啶（0.12 g，1.0 mmol）的二氯甲烷溶液（10 mL），室溫攪拌5 h；反應(yīng)液用1 mol·L-1硫酸氫鉀水溶液洗滌（50 mL×2），有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得目標(biāo)產(chǎn)物白色油狀物1.29 g（收率98.5%）。

2-(4-氧代-4-((2-三苯甲基巰基)乙基氨基)丁酰胺基)戊二酸雙十四醇二酯（10）的合成 將化合物9（1.00 g，2.4 mmol）、EDCI（0.54 g，2.8 mmol）、HOBt（0.38 g，2.8 mmol）溶于30 mL氯仿，室溫攪拌3 h，加入化合物1（1.17 g，2.2 mmol）和三乙胺（1.21 mL，8.7 mmol）的氯仿溶液20 mL，室溫攪拌12 h；反應(yīng)液用水洗滌（40 mL×2），再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，所得白色固體經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫溶劑：二氯甲烷-甲醇（130:1）]純化，得目標(biāo)產(chǎn)物白色固體1.51 g（收率74.0%）。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.34-7.11 (m, 15H, CH(C6H5)3), 4.48 (m, 1H, COCHNH), 4.01 (m, 4H, 2COOCH2), 3.00 (m, 2H, SCH2CH2), 2.45 (m, 2H, SCH2), 2.30 (m, 6H, OCOCH2, COCH2CH2CO), 2.10、1.89 (m, 2H, CHCH2), 1.53 (m, 4H, 2COOCH2CH2), 1.18 (m, 44H, 十四烷基中CH2), 0.83 (m, 6H, 2CH2CH3)。HRMS (ESI+) m/z: C58H88N2NaO6S [M+Na]+理論值963.6255, 實測值963.6273。IR (KBr壓片) σ(cm-1): 3 312, 3 060, 2 955, 2 922, 2 851, 1 744, 1733, 1642, 1 535, 1 468, 1 422, 1 326, 1 271, 1 196, 1 095, 1 034, 742, 722, 699。

2-(4-(2-巰基乙基)氨基-4-氧代丁酰胺基)戊二酸雙十四醇二酯（CS-E2C14）的合成 將化合物10（0.98 g，1.04 mmol）溶于15 mL二氯甲烷，0℃下滴加三氟乙酸（TFA，3.92 g，34.4 mmol）和三異丙基硅烷（TIS，0.18 g，1.15 mmol）的混合液，室溫攪拌2 h；反應(yīng)液旋干，所得淡黃色固體經(jīng)硅膠柱色譜[洗脫溶劑：二氯甲烷-甲醇（90:1）]純化，得目標(biāo)產(chǎn)物白色固體0.62 g（收率84.9%）[5]。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 4.57 (m, 1H, COCHNH), 4.09 (m, 4H, 2COOCH2), 3.42 (m, 2H, SHCH2CH2), 2.63 (m, 4H, SHCH2, COCH2CH2CO), 2.37 (m, 2H, COCH2CH2CO), 2.19 (m, 2H, CHCH2), 1.98 (m, 2H, CHCH2CH2CO), 1.61 (m, 4H, 2COOCH2CH2), 1.42-1.26 (m, 44H, 十四烷基中CH2), 0.90 (m, 6H, 2CH2CH3)。HRMS (ESI+) m/z: C50H98N3O6S2[M+H]+理論值900.6892, 實測值900.6907。IR (KBr壓 片) σ(cm-1): 3 311, 2 953, 2 918, 2 850, 1 740, 1 635, 1 555, 1 537, 1 465, 1 400, 1 277,1 193, 1 162, 1 130, 720。

2.3 H-SS-E2C14-L的制備

參照文獻[6]，將H-SS-E2C14作為脂質(zhì)體的修飾劑，通過薄膜分散法制備H-SS-E2C14-L。精密稱取H-SS-E2C14 20 mg、PC 20 mg及Chol 4 mg，置于茄形瓶中，加入5 mL三氯甲烷溶解，40 ℃下減壓蒸發(fā)成膜，抽真空除去殘余有機溶劑，加入5 mL純水，37 ℃水合30 min，冰浴探頭超聲15 min，超聲強度15%，過0. 22 μm微孔濾膜，即得H-SS-E2C14-L，其粒徑為（91.5±0.7）nm，表面電位為+（46.93±0.87）mV，置4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 H-SS-E2C14的降解動力學(xué)考察

采用HPLC法定量檢測H-SS-E2C14的降解動力學(xué)。精密吸取6份脂質(zhì)濃度相同的3 mL H-SS-E2C14-L樣品，其中3份加入3 mL 10 mmol·L-1GSH溶液（pH 7.4，含10 mmol·L-1Hepes），搖勻，氮氣保護密封，37℃水浴，分別于0、0.25、0.5、1、2、4、7、9、12、18、24 h精密吸取0.45 mL樣品，加入1 mL甲醇，超聲處理10 min，破乳后，加入3 mL二氯甲烷，渦旋 5 min，加入0.2 mL飽和食鹽水，靜置10 min，分層，取有機層真空揮干，加入0.2 mL乙腈-甲醇-二氯甲烷（40:30:30）混合溶劑，渦旋3 min，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣，進行HPLC分析；另3份加入3 mL不含GSH的10 mmol·L-1Hepes溶液（pH 7.4），同上處理。依據(jù)HPLC分析結(jié)果，繪制H-SS-E2C14在含或不含10 mmol·L-1GSH的介質(zhì)中的24 h降解曲線（見圖3）。

圖3 H-SS-E2C14在含或不含10 mmol·L-1GSH的介質(zhì)中的24 h降解曲線（ ±s, n=3）Figure 3 24 h-Degradation curves of H-SS-E2C14 in the media with or without 10 mmol·L-1GSH

由圖3可見，在含10 mmol·L-1GSH的介質(zhì)中，H-SS-E2C14的降解速率在最初的4 h內(nèi)較快，隨后逐漸減緩，24 h內(nèi)其累積降解率約為70%；而在不含GSH的介質(zhì)中，H-SS-E2C14在24 h內(nèi)幾乎沒有降解。這表明，載藥的H-SS-E2C14-L進入細胞質(zhì)后，可在GSH作用下因H-SS-E2C14中二硫鍵斷裂而降解，從而促使藥物自脂質(zhì)體中釋放。

3 討論

在還原敏感型陽離子寡肽脂質(zhì)材料H-SS-E2C14的合成過程中，化合物5與Boc-His(Tos)-OH反應(yīng)時，若使用EDCI/HOBt條件，化合物6的收率很低（＜50%），而使用縮合劑EDCI/NHS時，目標(biāo)產(chǎn)物的收率大幅提高，可達70%，究其原因，可能是在HOBt的存在下，致使組氨酸的Tos保護基部分脫去而形成副產(chǎn)物，從而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物收率降低；在化合物6脫保護的2步反應(yīng)中，若先用飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液脫Boc保護基，會導(dǎo)致形成的終產(chǎn)物極性不夠大而無法從乙酸乙酯中析出，造成后處理及純化的不便，因此應(yīng)先在HOBt作用下脫除Tos保護基，使氨基暴露，極性增大，進而脫除Boc保護基，這樣便可使終產(chǎn)物從飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液中順利析出。

在H-SS-E2C14的降解動力學(xué)考察實驗中，經(jīng)薄層色譜法檢測發(fā)現(xiàn)，H-SS-E2C14-L在10 mmol·L-1GSH溶液中孵育5 min后，其降解產(chǎn)物CS-E2C14的斑點就已出現(xiàn)，這定性表明此時脂質(zhì)體中已有二硫鍵斷裂并發(fā)生降解。但是，由于CS-E2C14無紫外可見光吸收，故無法采用HPLC法直接定量檢測出脂質(zhì)材料的降解產(chǎn)物，而H-SS-E2C14的咪唑環(huán)在291 nm處有紫外吸收，藉此，本文通過HPLC法測得H-SS-E2C14含量而間接定量檢測其降解速率。

H-SS-E2C14以二硫鍵作為陽離子頭部和疏水尾部之間的連接臂，并將組氨酸引入到陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)其與所載小分子干擾RNA（siRNA）形成的二元復(fù)合物被細胞攝取而進入內(nèi)涵體之后，組氨酸側(cè)鏈上咪唑環(huán)可發(fā)揮“質(zhì)子海綿”作用[7]，促進二元復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃逸到細胞質(zhì)中，二硫鍵則可在細胞質(zhì)的還原性環(huán)境下發(fā)生斷裂，將siRNA釋放出來[8]，因此，H-SS-E2C14-L有望成為一種有效的基因藥物載體。本文初步考察了H-SS-E2C14的降解動力學(xué)，而對于其與siRNA形成的二元復(fù)合物在細胞和動物水平上的基因沉默效果尚有待進一步探討與評價。

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Synthesis of a Novel Redox-responsive Cationic Oligopeptide Lipid and Its Degradation Dynamics in a Simulated Cytoplasmic Reducing Environment

WANG Lu, SUN Qiong, XU Xuefan, ZHANG Can
( Center of Drug Discovery, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Objective: To design and synthesize a novel redox-responsive cationic oligopeptide lipid material, which is used to prepare the liposome as a nucleic acid drug carrier that can be degraded, releaseing nucleic acid drugs in the cytoplasmic reducing environment. Methods: Using cystamine as disulfde bond donor, H-SS-E2C14, a redox-responsive cationic oligopeptide lipid material, was synthesized and it was used to prepare H-SSE2C14-L, a redox-responsive cationic oligopeptide liposome. Meanwhile, the degradation product of H-SS-E2C14 was synthesized with cysteamine as the starting material. The degradation kinetics of H-SS-E2C14 in a simulated cytoplasmic reducing environment was investigated quantitatively by HPLC. Results: The 24 h-accumulative degradation rate of the synthesized H-SS-E2C14 was about 70% in the simulated cytoplasmic reducing environment. Conclusion: The prepared H-SS-E2C14-L has the potential to be an ideal gene drug carrier.

redox-responsive cationic oligopeptide lipid; synthesis; nucleic acid drug carrier; disulfde bond; degradation kinetics

TQ460.4; R943

A

1001-5094（2014）07-0521-06

接受日期：2014-05-20

項目資助：國家自然科學(xué)基金（No. 81273468）

*通訊作者：張燦,教授；

研究方向：心腦血管藥物與高分子前藥；

Tel：025-83271171； E-mail: zhangcan@cpu.edu.cn