周利敏，劉曉蘭，劉 玥，鄭喜群

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

TGase催化玉米醇溶蛋白糖基化改性

周利敏，劉曉蘭，劉 玥，鄭喜群*

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）催化玉米醇溶蛋白與氨基葡萄糖鹽酸鹽（glucosamine hydrochloride，GAH）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確認(rèn)玉米醇溶蛋白與GAH發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。以玉米醇溶蛋白糖基化修飾產(chǎn)物中GAH導(dǎo)入量為指標(biāo)，優(yōu)化糖基化反應(yīng)條件，并對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化修飾樣品的溶解性進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，最適的糖基化反應(yīng)條件為底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL、TGase添加量50 U/g（以玉米醇溶蛋白計(jì)）、玉米醇溶蛋白中?；w與GAH中的?；荏w物質(zhì)的量比1∶6、初始pH 8.0、反應(yīng)溫度44 ℃、反應(yīng)時(shí)間7 h；此反應(yīng)條件下，玉米醇溶蛋白中GAH的最大導(dǎo)入量為（11.34±0.21） mg/g（以玉米醇溶蛋白計(jì)）。與玉米醇溶蛋白相比，玉米醇溶蛋白交聯(lián)樣品與糖基化修飾樣品的溶解性均得到提高，玉米醇溶蛋白糖基化修飾樣品的溶解性最高。

玉米醇溶蛋白；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；糖基化；蛋白質(zhì)改性

玉米醇溶蛋白是玉米蛋白質(zhì)的主要成分，約占玉米蛋白含量的68%～72%。玉米醇溶蛋白中主要的氨基酸為谷氨酸（含谷氨酰胺）（約為21%～26%）、亮氨酸（約為20%）、脯氨酸（約為10%）、丙氨酸（約為10%）[1]。其中，谷氨酰胺為T(mén)Gase催化蛋白質(zhì)與糖共價(jià)交聯(lián)的作用位點(diǎn)。非極性氨基酸含量高，堿性和酸性氨基酸缺乏，且賴氨酸和色氨酸含量極低，對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)，玉米醇溶蛋白是不完全蛋白質(zhì)。特殊的氨基酸組成造成玉米醇溶蛋白不溶于水，易溶于乙醇溶液、十二烷基硫酸鈉、高濃度尿素等有機(jī)溶劑的特性，限制了其在食品工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。

20世紀(jì)80年代已有糖與蛋白之間共價(jià)結(jié)合作用的相關(guān)報(bào)道?；谶@一結(jié)合特性，蛋白質(zhì)糖基化改性方面的研究逐漸得到展開(kāi)[2]。已有研究表明：蛋白質(zhì)多肽鏈中糖鏈的引入，使得蛋白質(zhì)的功能性，如溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、起泡性、凝膠性等得到顯著改善，甚至增加某些蛋白質(zhì)的抗氧化性、抑菌性和降低免疫原性[3]。

目前，酶法糖基化反應(yīng)主要是用糖基轉(zhuǎn)移酶[4]、糖苷酶[5]或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）[6-7]催化糖基連接到受體分子上。由于底物的高度專一性，糖基轉(zhuǎn)移酶很難在體外直接催化蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)。糖苷酶專一性較低，合成的糖基化產(chǎn)物很少。微生物TGase因來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、安全性高而被廣泛關(guān)注。Villalonga等[8]研究了TGase催化胰蛋白酶與β-環(huán)糊精衍生物交聯(lián)反應(yīng)條件，表征了修飾產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性；Jiang Shujuan等[9-10]研究了TGase催化大豆分離蛋白或酪蛋白與氨基葡萄糖鹽酸鹽（glucosamine hydrochloride，GAH）交聯(lián)反應(yīng)條件，表征了修飾產(chǎn)物的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)，均得到不同程度的改善。

玉米醇溶蛋白的改性大多利用化學(xué)方法，包括磷酸化[11]、?；痆12]、去酰胺[13]與交聯(lián)劑共價(jià)交聯(lián)[14]、美拉德糖基化[15]、成脂和成氫鍵改性[16]等。采用TGase催化玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)尚無(wú)報(bào)道。與化學(xué)方法相比，TGase催化玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、速率高、周期短、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用TGase催化GAH接枝到玉米醇溶蛋白分子上，優(yōu)化了糖基化反應(yīng)條件，以期為玉米醇溶蛋白在食品工業(yè)的研究及應(yīng)用提供基礎(chǔ)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉 中糧生化能源（龍江）有限公司；TGase（固體） 泰興市一鳴生物制品有限公司；D-GAH、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate, sodium salt-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）標(biāo)準(zhǔn)蛋白 上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的提取

采用60%～95%乙醇萃取法[17]。

1.2.2 原料理化指標(biāo)測(cè)定

玉米醇溶蛋白中總蛋白采用微量凱氏定氮法測(cè)定，參照GB 5009.5—1985《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法》；GAH中糖含量采用斐林試劑熱滴定法測(cè)定；玉米醇溶蛋白、GAH中水分含量采用恒重法測(cè)定，參照GB 5497—1985《糧食、油料檢測(cè)水分測(cè)定法》；TGase采用氧肟酸法測(cè)定，參照轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活測(cè)定方法[18]。

1.2.3 TGase催化玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)

將玉米醇溶蛋白（蛋白干基）按照一定底物質(zhì)量濃度配制成懸浮液，以反應(yīng)體系中?；w與?；荏w物質(zhì)的量比1∶6添加GAH，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)整初始pH值至7.5。TGase添加量為50 U/g（以玉米醇溶蛋白計(jì)，下同），混勻，于37 ℃恒溫水浴振蕩中反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后樣品于85 ℃沸水中滅酶5 min，冷卻。4 ℃透析48 h除去未交聯(lián)的GAH，樣品凍干備用。

1.2.4 樣品中氨基葡萄糖含量的測(cè)定

酸水解后的樣品過(guò)濾后，用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至偏堿性，取1.5 mL，加入1.5 mL DNS試劑，沸水中反應(yīng)5 min，冷卻后補(bǔ)加1.0 mL蒸餾水，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.003x－0.101 3， R2=0.998）中，計(jì)算糖含量。重復(fù)3 次測(cè)定，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 SDS-PAGE確認(rèn)玉米醇溶蛋白與氨基葡萄糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)

SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)染色參照郭堯君[19]、Laemmli[20]等的方法。糖蛋白染色和脫色參照Z(yǔ)acharius等[21]的方法。標(biāo)準(zhǔn)蛋白如下：磷酸酶b（97.4 kD）、牛血清白蛋白（66.2 kD）、卵白蛋白（43.0 kD）、碳酸苷酶（31.0 kD）、胰蛋白酶抑制劑（20.1 kD）、溶菌酶（14.4 kD）。辣根過(guò)氧化物酶（糖蛋白）作為陽(yáng)性對(duì)照，玉米醇溶蛋白作為陰性對(duì)照。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)蛋白染色顯示玉米醇溶蛋白與GAH發(fā)生糖基化反應(yīng)后分子質(zhì)量變化情況；通過(guò)PAS染色法，即過(guò)碘酸雪夫染色法檢測(cè)玉米醇溶蛋白糖基化修飾產(chǎn)物中糖基的存在，以辣根過(guò)氧化物酶為陽(yáng)性對(duì)照品，確認(rèn)糖蛋白。

1.2.5.1 電泳實(shí)驗(yàn)

配制3 g/L的蛋白溶液，取100 μL于1.0 mL離心管中，與樣品緩沖溶液1∶1混合，10 000 r/min離心5 min，取上清液沸水浴中煮沸5 min后冷卻備用。進(jìn)樣量每孔10 μL。分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%和3%，并分別設(shè)定電壓為120 V和80 V時(shí)進(jìn)行電泳。

1.2.5.2 蛋白質(zhì)染色和脫色

用蛋白質(zhì)固定液（甲醇、冰乙酸、水體積比為2∶1∶7）固定膠片1 h后，將膠片放入蛋白質(zhì)染色液中（含0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、45%甲醇、10%冰乙酸）染色6 h左右，然后用脫色液（甲醇、冰乙酸、水體積比為1∶1∶8）進(jìn)行脫色，更換脫色液直至條帶清晰、背景顏色完全褪去為止。

1.2.5.3 糖蛋白染色和脫色

用糖蛋白固定液（12.5%三氯乙酸）固定膠片15 min，雙蒸水洗2 次。1%高碘酸處理15 min，振蕩水洗5 min，3 次。膠片浸于希夫試劑（Schiff試劑），室溫避光染色30 min。染色結(jié)束倒去染色液，用0.5%偏重亞硫酸鈉洗脫液振蕩水洗5 min，5 次。利用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)染色成像和糖染色成像。在兩塊膠中對(duì)應(yīng)位置同時(shí)被染色的物質(zhì)就是糖蛋白。

1.2.6 樣品溶解性的測(cè)定

1.2.6.1 樣品制備

按照1.2.3節(jié)所示方法，最適條件制備玉米醇溶蛋白修飾樣品，透析后調(diào)pH值為7.0，樣品凍干，備用。不加GAH，其他條件相同，制備對(duì)照品1：玉米醇溶蛋白交聯(lián)樣品。對(duì)照品2：玉米醇溶蛋白，復(fù)溶后，調(diào)pH 7.0，凍干備用。

1.2.6.2 溶解性測(cè)定

準(zhǔn)確稱量0.060 0g（蛋白干基）樣品及對(duì)照品，加入10 mL pH 2～12的緩沖溶液，漩渦混勻30 s，置于4 ℃過(guò)夜使其充分水合，8 000×g、4 ℃離心10 min，轉(zhuǎn)出上清液，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其上清液在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度（水調(diào)零）。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，玉米醇溶蛋白中總蛋白含量為90.41%；GAH中糖含量為96.28%；玉米醇溶蛋白、GAH中水分含量分別為5.13%、0.18%；TGase比活力為1.05×103U/g。

2.2 底物質(zhì)量濃度對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

在TGase添加量60 U/g、酰基供受體物質(zhì)的量比1∶6添加GAH、初始pH 7.5、溫度37 ℃、反應(yīng)時(shí)間8 h條件下，探索不同的底物質(zhì)量濃度3、4、5、6 g/100 mL對(duì)玉米醇溶蛋白與GAH糖基化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 玉米醇溶蛋白修飾樣品接糖量隨底物質(zhì)量濃度變化情況Fig.1 Relationship between the amount of GAH conjugated onto zein and substrate concentration

由圖1可見(jiàn)，隨底物質(zhì)量濃度升高，玉米醇溶蛋白中糖基導(dǎo)入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，5 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大值，為5.37 mg/g?？赡艿脑?yàn)?，相同反?yīng)體系下，一定程度內(nèi)底物質(zhì)量濃度越高，TGase的作用位點(diǎn)越多，催化速率加快，玉米醇溶蛋白中GAH導(dǎo)入量越大。TGase還可以催化蛋白質(zhì)形成自交聯(lián)，底物質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，玉米醇溶蛋白分子自交聯(lián)的程度也增大，所產(chǎn)生的空間位阻較大，阻礙了糖基的導(dǎo)入。Yan[22]等報(bào)道了大分子的寡糖糖基導(dǎo)入蛋白分子中會(huì)影響相鄰位點(diǎn)上糖基的導(dǎo)入，這與分子的空間位阻增大有關(guān)。

2.3 TGase添加量對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL時(shí)，探索不同的TGase添加量（40、50、60、70 U/g）對(duì)玉米醇溶蛋白與GAH糖基化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 玉米醇溶蛋白修飾樣品接糖量隨TGase添加量變化情況Fig.2 Relationship between the amounts of GAH conjugated onto zein and TGase dosage

由圖2可見(jiàn)，隨TGase添加量升高，玉米醇溶蛋白中糖基導(dǎo)入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，50 U/g時(shí)達(dá)到最大值，為5.48 mg/g。根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相關(guān)知識(shí)，當(dāng)反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度足夠大時(shí)，最大反應(yīng)速度與酶濃度成正比。由米氏方程可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度一定時(shí)，酶促反應(yīng)速度正比于最大反應(yīng)速率。因此，底物質(zhì)量濃度一定時(shí)，酶促反應(yīng)速率與酶濃度成正比。但當(dāng)TGase添加量過(guò)高時(shí)，加大了玉米醇溶蛋白分子自交聯(lián)的程度，較大的空間位阻阻礙糖基的導(dǎo)入。因此，TGase的濃度不宜過(guò)高。

2.4 GAH添加量對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

TGase添加量50 U/g時(shí)，探索不同的GAH添加量（?；┦荏w物質(zhì)的量比1∶5、1∶6、1∶7）對(duì)玉米醇溶蛋白與GAH糖基化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 玉米醇溶蛋白修飾樣品接糖量隨?；┦荏w物質(zhì)的量比變化情況Fig.3 Relationship between the amount of GAH conjugated onto zein and GAH concentration

由圖3可見(jiàn)，隨GAH添加量升高，玉米醇溶蛋白中糖基導(dǎo)入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)?；┦荏w物質(zhì)的量比1∶6時(shí)達(dá)到最大值，為9.17 mg/g?？赡艿脑?yàn)椋?dāng)GAH添加量較少時(shí)，玉米醇溶蛋白與GAH分子間有效碰撞幾率較小，導(dǎo)致糖基化反應(yīng)發(fā)生的幾率較小。但GAH添加量過(guò)高易形成高黏度的糖溶液，阻礙體系中分子的擴(kuò)散，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。李志銳等[23]等研究了不同濃度的葡萄糖溶液對(duì)玉米醇溶蛋白黏度的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高，玉米醇溶蛋白的黏度越大。

2.5 初始pH值對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

?；┦荏w物質(zhì)的量比1∶6時(shí)，探索不同的初始pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對(duì)玉米醇溶蛋白與GAH糖基化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 玉米醇溶蛋白修飾樣品接糖量隨初始pH值變化情況Fig.4 Relationship between the amount of GAH conjugated onto zein and initial reaction pH

由圖4可見(jiàn)，隨初始pH值升高，玉米醇溶蛋白中糖基導(dǎo)入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為8.0時(shí)達(dá)到最大值，為10.58 mg/g?？赡艿脑?yàn)椋衩状既艿鞍椎牡入婞c(diǎn)為pH 6.0左右，在pH6.5～8.5范圍內(nèi)，玉米醇溶蛋白的溶解性隨pH值增大而增大，體系中可溶性玉米醇溶蛋白的濃度升高，GAH可接觸的谷氨酰胺位點(diǎn)增多，使得玉米醇溶蛋白中糖基的導(dǎo)入量增加。反應(yīng)pH值是影響酶活力的一個(gè)重要因素，TGase最適pH值為6.0，在pH 5.0～8.0之間也有較高的活性。但pH 6.0為玉米醇溶蛋白的等電點(diǎn)，不利于反應(yīng)進(jìn)行。pH 6.5～8.0時(shí)，TGase的比活力相對(duì)較穩(wěn)定，pH 8.0時(shí)為1006 U/g，稍低于pH 6.0。當(dāng)反應(yīng)初始pH值為8.5時(shí)，TGase的活性降低為988 U/g。從而，相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，TGase催化玉米醇溶蛋白中GAH的導(dǎo)入量減少。

2.6 反應(yīng)溫度對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

圖5 玉米醇溶蛋白修飾樣品接糖量隨反應(yīng)溫度變化情況Fig.5 Relationship between the amount of GAH conjugated onto zein and reaction temperature

當(dāng)初始pH值8.0時(shí)，探索不同的反應(yīng)溫度（30、37、44、51 ℃）對(duì)玉米醇溶蛋白與GAH糖基化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見(jiàn)，隨著反應(yīng)溫度升高，玉米醇溶蛋白中糖基導(dǎo)入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度為44 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為10.79 mg/g。TGase的最適反應(yīng)溫度為50 ℃左右，在40～55 ℃范圍內(nèi)都有較高活性。一定范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，TGase活性增強(qiáng)，有利于糖基化反應(yīng)進(jìn)行，同時(shí)，TGase催化的糖基化反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)脫酰胺作用也加劇。所以，反應(yīng)溫度不宜過(guò)高。

2.7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化反應(yīng)的影響

圖6 玉米醇溶蛋白修飾樣品接糖量隨反應(yīng)時(shí)間變化關(guān)系Fig.6 Relationship between the amount of GAH conjugated onto zein and reaction time

當(dāng)反應(yīng)溫度44 ℃時(shí)，探索不同的反應(yīng)時(shí)間（5、6、7、8 h）對(duì)玉米醇溶蛋白與氨基葡萄糖糖基化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可見(jiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，玉米醇溶蛋白中糖基導(dǎo)入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為7 h時(shí)達(dá)到最大值，為11.34 mg/g。5～7 h期間，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，玉米醇溶蛋白中GAH的導(dǎo)入量逐漸增多；反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)到8 h，GAH的導(dǎo)入量下降?？赡艿脑?yàn)?，在?dāng)前弱堿性反應(yīng)條件下，生成的玉米醇溶蛋白糖基化修飾產(chǎn)物可能不穩(wěn)定降解。同時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，TGase催化的玉米醇溶蛋白分子中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基和自身或相鄰玉米醇溶蛋白分子中的賴氨酸的ε-氨基發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，形成ε-（γ-谷酰胺）-賴氨酸的異肽鍵，生成蛋白-蛋白交聯(lián)的大分子，此蛋白大分子空間位阻增大，不利于糖基的導(dǎo)入。

2.8 玉米醇溶蛋白與GAH糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE

圖7 玉米醇溶蛋白糖基化修飾樣品的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 Electrophoretic profiles of modified zein

如圖7所示，蛋白染色與玉米醇溶蛋白（泳道1）相比，糖基化的玉米醇溶蛋白（泳道2）中分子質(zhì)量60 kD左右多了條帶，這可能是由于GAH接枝到玉米醇溶蛋白分子中而形成的大分子。經(jīng)糖蛋白染色（PAS法）后確定此條帶處含有糖基。與玉米醇溶蛋白相比，糖基化修飾后的玉米醇溶蛋白的兩個(gè)亞基發(fā)生明顯的變化：蛋白染色中亞基顏色加深（A圖中泳道2），這可能是由于糖基的導(dǎo)入，使得玉米醇溶蛋白的溶解性增加；糖蛋白染色中亞基顏色加深（B圖中泳道2’），證明玉米醇溶蛋白的兩個(gè)亞基中也含有糖基，再一次證實(shí)了GAH導(dǎo)入了玉米醇溶蛋白分子中。

2.9 糖基化玉米醇溶蛋白的溶解性

圖8 玉米醇溶蛋白樣品的溶解性Fig.8 Solubility of zein samples

由圖8可以看出，與玉米醇溶蛋白相比，玉米醇溶蛋白交聯(lián)樣品和糖基化修飾樣品的溶解性均升高。在測(cè)定的所有pH值范圍內(nèi)，玉米醇溶蛋白修飾樣品的溶解性均最高，等電點(diǎn)處改善的最明顯。可能是因?yàn)橛H水性極強(qiáng)的糖基的導(dǎo)入，玉米醇溶蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增強(qiáng)了玉米醇溶蛋白與水分子之間的相互作用。這與姜淑娟等[24]的研究結(jié)果相一致。

TGase催化玉米醇溶蛋白交聯(lián)后，等電點(diǎn)向酸性pH值偏移。可能的原因?yàn)?，相比于玉米醇溶蛋白自身交?lián)，TGase催化的另一種作用機(jī)制更為突出——脫氨作用、脫胺作用使得玉米醇溶蛋白中的谷氨酰胺殘基與水分子結(jié)合，生成谷氨酸，暴露出羧基，放出NH3，使等電點(diǎn)改變，溶解度升高，這與Babiker[25]的研究結(jié)果一致。此外，玉米醇溶蛋白中賴氨酸含量極低，在TGase催化作用下，玉米醇溶蛋白分子內(nèi)或間發(fā)生交聯(lián)作用較弱。

3 結(jié) 論

SDS-PAGE法證實(shí)了GAH接枝到了玉米醇溶蛋白分子中。確定的玉米醇溶蛋白與GAH最適糖基化反應(yīng)條件為：底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL、TGase添加量50 U/g、玉米醇溶蛋白中?；w與GAH中?；荏w物質(zhì)的量比1∶6、初始pH 8.0、反應(yīng)溫度44 ℃、反應(yīng)時(shí)間7 h。該條件下，玉米醇溶蛋白中GAH最大接入量為（11.34±0.21）mg/g。

與玉米醇溶蛋白相比，TGase催化玉米醇溶蛋白交聯(lián)樣品及玉米醇溶蛋白糖基化修飾樣品的溶解性均得到較大提高；且在所有pH值范圍內(nèi)，玉米醇溶蛋白糖基化修飾樣品的溶解性最高。

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TGase-Catalyzed Glycosylation of Zein

ZHOU Li-min, LIU Xiao-lan, LIU Yue, ZHENG Xi-qun*
(Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University, College of Food and Biological Engineering, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

In the present work, transglutaminase (TGase) was used to catalyze covalent cross-linking reaction between zein and glucosamine hydrochloride (GAH). The cross-linking reaction was identified by SDS-PAGE. The reaction conditions were optimized based on the amount of GAH conjugated onto zein. Meanwhile, the solubility of zein modified by glycosylation was characterized. The results showed that the optimized reaction conditions for TGase/zein concentration, zein ratio molar ratio of acyl donor to acceptor, initial reaction pH, temperature and reaction time were 5 g/100 mL, 50 U/g, 1:6, 8.0, 44 ℃ and 7 h respectively. Under these conditions, the amount of GAH conjugated onto zein was (11.34 ± 0.21) mg/g zein. Compared with intact zein, the solubility of both cross-linked zein and glycosylated zein was improved, and glycosylation resulted in the highest solubility.

zein; transglutaminase (TGase); glycosylation; protein modification

Q814.9

A

1002-6630（2014）24-0015-05

10.7506/spkx1002-6630-201424003

2014-08-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371726）

周利敏（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛衩拙C合加工技術(shù)與轉(zhuǎn)化。E-mail：zhoulimin19890111@163.com*

鄭喜群（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橛衩拙C合加工技術(shù)與轉(zhuǎn)化。E-mail：zhengxiqun@126.com