羅世坤，王家歡，徐蘭英，龍 濤,*，李士明,2,*

（1.黃岡師范學(xué)院化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.羅格斯大學(xué)食品科學(xué)系，美國 新澤西州 新布朗士維克 08901）

陳皮中川陳皮素的提取分離及改性

羅世坤1，王家歡1，徐蘭英1，龍 濤1,*，李士明1,2,*

（1.黃岡師范學(xué)院化工學(xué)院，催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.羅格斯大學(xué)食品科學(xué)系，美國 新澤西州 新布朗士維克 08901）

以陳皮中川陳皮素的提取、分離純化以及改性為目的，采用無水乙醇浸提陳皮得浸膏，以氯仿為萃取劑萃取浸膏，得到多甲氧基黃酮混合物，再以硅膠為吸附劑、乙酸乙酯和石油醚的混合液為洗脫劑，采用柱色譜法分離多甲氧基黃酮化合物，經(jīng)高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜檢測并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，最終確證得到川陳皮素純品。研究從川陳皮素到5-去甲基川陳皮素的合成路線，優(yōu)化了改性條件，在濃鹽酸與無水乙醇體積比為1∶9條件下，將川陳皮素加熱回流反應(yīng)24 h，可以得到純度大于97%的5-去甲基川陳皮素。

陳皮；分離純化；多甲氧基黃酮；川陳皮素；5-去甲基川陳皮素

陳皮為蕓香科（Rutaceae）植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，分為陳皮和廣陳皮[1]。陳皮中含有黃酮類、檸檬苦素類、生物堿類、揮發(fā)油及其他成分[2]，能有效地改善和提高小腸的消化功能，對(duì)心臟有興奮作用，還具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤等作用[3]。

陳皮中的黃酮化合物種類與含量非常豐富，其活性與內(nèi)含化合物的黃酮種類和含量都有著直接關(guān)系。已有研究[4-8]發(fā)現(xiàn)橘皮中多羥基黃酮和黃烷酮具有很好的抗氧化作用，能夠有效清除自由基，降低慢性疾病的發(fā)病率，并且具有很強(qiáng)的抗炎、抗癌活性。而多甲氧基黃酮的生物活性在最近幾年開始引起重視。多甲氧基黃酮具有抗炎、防癌抗癌、降低膽固醇和防止膽固醇氧化等生物學(xué)活性[9-15]。最近研究表明，多甲氧基混合物的衍生物，5-去甲基多甲氧基化合物不但有更強(qiáng)的抗炎抗癌活性[9-10]，還具有很好的抗癌作用[16-17]。目前研究較多的是橘皮中3個(gè)主要多甲氧基黃酮化合物，即陳皮素、川陳皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮，以及它們的5-去甲基衍生物，即5-去甲基陳皮素、5-去甲基川陳皮素和5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮[16-18]。

目前分離提取黃酮類化合物的方法主要有超聲提取法、大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法、超臨界流體萃取法、高速逆流色譜法[19-24]。趙雪梅等[23]采用反復(fù)硅膠柱層析的方法，從常山胡柚中分離出了橙皮苷、5,7,4’-三羥基二氫黃酮、川陳皮素、柑橘黃酮、5-羥基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黃酮、5-羥基-3,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮6種黃酮類化合物。

本研究采用硅膠柱層析法，以乙酸乙酯-石油醚為淋洗液，對(duì)陳皮中黃酮類化合物進(jìn)行了分離純化，得到較高純度的川陳皮素，含量達(dá)到99.7%。對(duì)川陳皮素進(jìn)行修飾，得到含量大于97%的5-去甲基川陳皮素，為陳皮的作用機(jī)理研究提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮 湖北黃州百聯(lián)大藥房。

無水乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯（分析純）、乙腈（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸（分析純） 中國平煤神馬集團(tuán)開封東大化工有限公司試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

2XZ-1型旋片式真空泵 臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司；CCA-20低溫冷卻水循環(huán)泵、SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DZTW調(diào)溫電熱套 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；2695型高效液相色譜（high performance liquid chromatograpy，HPLC）儀美國Waters公司；5975C型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograpy-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分離條件

HPLC條件：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）液相色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～55%乙腈；15～20 min，55%～70%乙腈；20～25 min，70%～80%乙腈；25～30 min，80%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：326 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

GC-MS條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比50∶1；起始溫度60 ℃，以50 ℃/min速率升溫至300 ℃，保持10 min；進(jìn)樣體積1 μL，質(zhì)譜離子掃描范圍為m/z 50～550。

1.3.2 川陳皮素的提取分離

提?。簩㈥惼し勰┖蜔o水乙醇按固液比1∶10進(jìn)行混合，浸泡48 h后過濾，將得到的濾液旋蒸至稠膏狀。

萃?。簩⒊頎钗镉眠m量氯仿-水（體積比為1∶1）溶液溶解，振蕩一段時(shí)間后靜置，取氯仿層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得多甲基黃酮混合物。

裝柱：將1.6 g多甲基黃酮混合物溶于少量氯仿。取100 g硅膠（200～300目）于燒杯中，加入適量石油醚，攪拌，以濕法將硅膠裝入6 cm×30 cm的層析柱中，上層加入適量海沙，待石油醚液面降至海沙表面時(shí)，加入多甲基黃酮混合物溶液。

洗脫：依次用350 mL乙酸乙酯-石油醚溶液進(jìn)行洗脫，其中乙酸乙酯含量分別為35%、55%、75%、85%、95%，每50 mL收集一瓶，從第1瓶開始按順序編號(hào)，直到95%的洗脫液洗脫完畢。

檢測：分別將樣品瓶中的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的固體物質(zhì)用無水乙醇定容至25 mL，用HPLC進(jìn)行測定。

1.3.3 川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線

稱取川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇配制成0.4 mg/mL儲(chǔ)備液，然后將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.04、0.08、0.10、0.20 mg/mL的工作溶液，用HPLC進(jìn)行檢測，繪制工作曲線。

1.3.4 5-去甲氧基川陳皮素的制備

取20 mg川陳皮素置于100 mL圓底燒瓶中，加入18 mL無水乙醇和2 mL濃鹽酸，加熱回流一定時(shí)間，將回流后的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到金黃色固體；將固體用50 mL乙酸乙酯-水（體積比1∶1）溶液溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置，溶液分層。取上層溶液，加入20 mL水，振蕩分液漏斗，使溶液充分混合，靜置，取上層溶液；將此溶液旋蒸得到固體物，用無水乙醇溶解并定容至100 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線

將配制好的川陳皮素工作溶液進(jìn)行HPLC檢測，以溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)作圖，得工作曲線，線性方程為Y=0.001 6X+0.001 4，其中Y為溶液質(zhì)量濃度，X為吸收峰面積。方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9，表明質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 正相色譜分離多甲氧基黃酮

用5 種不同乙酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的洗脫劑（乙酸乙酯與石油醚組成）洗脫，分別收集到37 個(gè)樣品瓶中，由洗脫過程中用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）跟蹤判斷1～3號(hào)樣品瓶為石油醚，4～10、11～17、18～24、25～31、32～37號(hào)樣品瓶分別是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、55%、75%、85%、95%乙酸乙酯的洗脫劑洗脫所得溶液。

HPLC檢測結(jié)果中，35%乙酸乙酯洗脫劑洗脫之后主要得到5 種物質(zhì)，其中第8號(hào)樣品瓶的液相色譜分離結(jié)果見圖1A。該組分中保留時(shí)間在13 min以后的化合物含量很高，說明35%乙酸乙酯洗脫劑可將極性較小的物質(zhì)洗脫下來，根據(jù)文獻(xiàn)[9,16]判斷，這部分化合物是5-去甲基多甲氧基黃酮。由對(duì)川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果可知，川陳皮素的保留時(shí)間約為11.5 min，所以此溶液中的物質(zhì)都是極性較弱的物質(zhì)，與黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，可以確定保留時(shí)間為13.6 min的物質(zhì)為橘皮素，因而可以加大洗脫劑極性，使保留時(shí)間較短的物質(zhì)洗脫出來。

用55%乙酸乙酯洗脫劑洗脫之后主要得到兩種物質(zhì)，其中第15號(hào)樣品的色譜分離結(jié)果見圖1B。保留時(shí)間為13.6 min的橘皮素在35%乙酸乙酯洗脫劑的洗脫液中也有出現(xiàn)；保留時(shí)間為12.7 min的物質(zhì)是新洗脫下來的一種物質(zhì)，經(jīng)與黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比液相色譜保留時(shí)間，確定其為3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮。 由圖1B還可明顯看出，55%的乙酸乙酯洗脫劑幾乎不能將川陳皮素洗脫下來，川陳皮素含量僅為0.48%，所以進(jìn)一步加大了洗脫劑極性。

圖1 多甲基黃酮液相色譜圖Fig.1 HPLC of polymethoxylated flavonoids

用75%乙酸乙酯洗脫劑洗脫下來的主要有3 種物質(zhì)，其中第18號(hào)樣品的色譜分離結(jié)果見圖2A。由圖2可知，洗脫液中還有橘皮素和3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮，保留時(shí)間為11.1 min處出現(xiàn)了新的色譜峰，經(jīng)對(duì)比黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間初步確定為川陳皮素。圖2B為75%乙酸乙酯洗脫劑繼續(xù)洗脫得到的第24號(hào)樣品液相色譜圖，可以看出，此時(shí)保留時(shí)間大于11 min的黃酮化合物已幾乎全部被洗脫下來，保留時(shí)間為9.2 min的物質(zhì)已經(jīng)出現(xiàn)，對(duì)比黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜可知該物質(zhì)為3,5,6,7,3’,4’-六甲氧基黃酮，此時(shí)川陳皮素的峰面積很小，可以判斷川陳皮素已幾乎被完全洗脫下來。

圖2 75 2 75%乙酸乙酯洗脫多甲基黃酮液相色譜圖Fig.2 HPLC of polymethoxylated flavonoids eluted by 75% EtOAc/25% petroleum ether

圖3 第20號(hào)樣品液相色譜圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.3 HPLC (A) and mass spectrum (B) of sample 20

從第20號(hào)樣品的液相色譜圖（圖3A）可以看出，溶液中幾乎只有川陳皮素一種物質(zhì)峰，通過峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，其純度高達(dá)99.7%。取該樣品同時(shí)進(jìn)行GC-MS檢測，結(jié)果見圖3B，其分子離子峰為402.1，和川陳皮素（標(biāo)準(zhǔn)品）一致，進(jìn)一步證實(shí)分離得到的物質(zhì)為川陳皮素。

2.3 5-去甲基川陳皮素的制備

稱取3 份20 mg川陳皮素粉末于100 mL圓底燒瓶中，分別加入20 mL濃鹽酸與無水乙醇混合液（無水乙醇-濃鹽酸體積比9∶1），加熱回流分別反應(yīng)12、24 h和30 h。然后將反應(yīng)液減壓濃縮，濃縮物溶于乙酸乙酯，水洗，再減壓濃縮，將產(chǎn)物溶解于無水乙醇并定容至100 mL，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)5-去甲基川陳皮素產(chǎn)率的影響。

圖4 5-去甲氧基川陳皮素液相色譜圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.4 HPLC (A) and mass spectrum (B) of 5-demethynobiletin

圖4A為反應(yīng)液反應(yīng)24 h后的液相色譜圖和質(zhì)譜圖。可以看出，保留時(shí)間為11.1 min的川陳皮素峰已基本消失，保留時(shí)間為16.7 min處出現(xiàn)明顯的色譜峰，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，初步確定此物質(zhì)為5-去甲基川陳皮素，采用面積歸一化法得其純度達(dá)97.5%。取該樣品同時(shí)進(jìn)行GC-MS檢測，結(jié)果如圖4B，其分子離子峰為388.1，和5-去甲基川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品一致，證實(shí)制備得到的物質(zhì)為5-去甲基川陳皮素。

表1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)5-去甲基川陳皮素制備的影響Table 1 Effect of reaction time on the preparation of 5-demethynobiletin

結(jié)合表1分析可知，回流反應(yīng)12 h后5-去甲基川陳皮素轉(zhuǎn)化率不高，回流24 h后已基本反應(yīng)完全，當(dāng)回流時(shí)間達(dá)到30 h時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率提高并不明顯。鑒于環(huán)保節(jié)能的理念，今后大量合成最佳反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制為24 h，這樣既節(jié)約合成時(shí)間，也能有一個(gè)較高的產(chǎn)率。

3 結(jié) 論

陳皮和川陳皮素具有很強(qiáng)的生物活性[25]，而川陳皮素是陳皮中3 個(gè)主要多甲氧基黃酮之一，含量高于其他多甲氧基黃酮，因此，從陳皮中分離鑒定川陳皮素，對(duì)于陳皮的生物活性機(jī)理研究具有重意義。 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)陳皮中川陳皮素純品的提取分離等條件的研究，成功地用硅膠柱，以25%石油醚和75%乙酸乙酯為洗脫劑，分離得到了川陳皮素純品，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

已有研究[9]指出了5-去甲基川陳皮素具有比川陳皮素更強(qiáng)的生物活性，因此，本實(shí)驗(yàn)研究了從川陳皮素到5-去甲基川陳皮素的合成路線，并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，確定了較優(yōu)的合成方案。在濃鹽酸與無水乙醇體積比為1∶9的溶液中，將川陳皮素加熱回流反應(yīng)24 h，可以得到純度大于97%的5-去甲基川陳皮素。

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Extraction and Modification of Nobiletin from Tangerine Peel

LUO Shi-kun1, WANG Jia-huan1, XU Lan-ying1, LONG Tao1,*, LI Shi-ming1,2,*
(1. Hubei Key Laboratory for Processing and Application of Catalytic Materials, College of Chemical Technology, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China; 2. Department of Food Science, Rutgers University, New Brunswick 08901, USA)

The aim of this research is to extract, purify and modify nobiletin from dried orange peel. The extraction process was carried out by means of infiltration. The extract was further extracted with chloroform to obtain a fraction rich in polymethoxylated fl avonoids and the target compounds were separated on a silica gel column with a mobile phase consisting of a mixture of ethyl acetate and petroleum ether. Pure nobiletin was obtained as indicated by reversed phase HPLC and GC-MS and through comparison with reference standards. The conversion conditions from nobiletin to 5-demethylnobiletin was optimized and it was found that 5-demethylnobiletin with a purity higher than 97% was produced when the reaction was performed for 24 h under heat refl uxing condition with a volume ratio of 1:9 between concentrated hydrochloric acid and absolute ethanol.

citrus peel; separation and purification; polymethoxylated flavonoids; nobiletin; 5-demethynobiletin

O6-332

A

1002-6630（2014）24-0020-04

10.7506/spkx1002-6630-201424004

2014-07-15

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21205046）；湖北省科技廳對(duì)外合作項(xiàng)目（2014BHE036）；經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)開放基金項(xiàng)目（2013001603）

羅世坤（1990—），男，學(xué)士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：326966605@qq.com

*通信作者：龍濤（1979—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：longtao@hgnu.edu.cn李士明（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：Shiming@rutgers.edu