胡勤玲，鄭良清，王 申，易 青，吳永寧，宮智勇*

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023）

基于電子舌對(duì)富含ACE抑制肽大米蛋白水解物的脫苦評(píng)價(jià)

胡勤玲，鄭良清，王 申，易 青，吳永寧，宮智勇*

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023）

利用風(fēng)味酶、活性炭、β-環(huán)狀糊精對(duì)大米蛋白水解液進(jìn)行脫苦，采用電子舌技術(shù)評(píng)價(jià)脫苦效果，并用高效液相色譜法評(píng)價(jià)脫苦前后的水解物對(duì)血管緊張 素轉(zhuǎn)化酶活性抑制效果變化，探討大米蛋白水解物的最佳脫苦工藝。結(jié)果表明，風(fēng)味酶法脫苦的最佳處理?xiàng)l件為加酶量2.5%、水解時(shí)間20 min、水解pH 5.8；活性炭脫苦的最佳處理?xiàng)l件為活性炭用量2.0%、料液溫度60℃、處理時(shí)間20 min、料液pH 7.0；β-環(huán)狀糊精脫苦的最佳處理?xiàng)l件為10% β-環(huán)狀糊精包埋30 min。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽；脫苦；電子舌；風(fēng)味酶；活性炭；β-環(huán)狀糊精

大米蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，經(jīng)過(guò)水解的大米蛋白，可釋放出一定的氨基酸和生物活性肽，增大蛋白分子極性，在增大其溶解性的同時(shí)，其發(fā)泡、乳化等性質(zhì)也表現(xiàn)出來(lái)。隨著溶解度增加，其泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性卻并未呈現(xiàn)規(guī)律性變化?；诖竺椎鞍兹芙庑圆畹奶攸c(diǎn)，對(duì)大 米蛋白進(jìn)行水解獲得 活性多肽就具有很高的研究?jī)r(jià)值[1-3]。生物活性肽是指有益于生物機(jī)體的生命活動(dòng)或者具有生理作 用的肽類(lèi)化合物，又稱功能肽，它們具有多種生理功能，如激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等[4-5]。

酶法水解蛋白質(zhì)可得到多種具有高血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE）活性抑制作用的降壓肽，但在水解的同時(shí)也會(huì)有相應(yīng)的苦味肽形成，嚴(yán)重影響其可食性[6]。苦味肽的分子鏈中都含有疏水性的環(huán)狀氨基酸結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的苦味均與舌部味蕾細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)?？辔痘衔锱c舌部味蕾膜蛋白相互結(jié)合后，其疏水基更大程度增加了分子間的結(jié)合力，并使結(jié)合產(chǎn)物之間的氫鍵共價(jià)鍵及離子鍵等之間的結(jié)合更加穩(wěn)定。因此，通常的水溶液很難使已與味蕾蛋白結(jié)合的苦味肽游離出來(lái)。有學(xué)者已對(duì)這些苦味物質(zhì)作過(guò)不同程度的研究，這些物質(zhì)是一些疏水性的肽類(lèi)，國(guó)外有報(bào)道用酶法類(lèi)蛋白反應(yīng)覆蓋法來(lái)解決苦味，仍處于理論研究狀態(tài)，對(duì)苦味去除的系統(tǒng)研究和脫苦的大米蛋白功能產(chǎn)品國(guó)內(nèi)報(bào)道較少[7-8]。

為得到口感和風(fēng)味俱佳的多肽產(chǎn)品，人們?cè)诳茖W(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中針對(duì)性找到許多消除和降低蛋白酶解產(chǎn)物的脫苦技術(shù)?，F(xiàn)代主要脫苦方法有物理脫苦、酶法脫苦和微生物脫苦3種。對(duì)苦味的評(píng)價(jià)長(zhǎng)期以來(lái)主要采用感官評(píng)定法，但其結(jié)果不夠客觀，易受環(huán)境、評(píng)價(jià)者情緒、健康狀況等的影響[9-10]。電子舌作為一種快速檢測(cè)味覺(jué)品質(zhì)的新技術(shù)，能夠以類(lèi)似人的味覺(jué)感受方式檢測(cè)出味覺(jué)物質(zhì)，可以對(duì)樣品進(jìn)行量化，同時(shí)可以對(duì)一些成分含量進(jìn)行測(cè)量，具有高靈敏度、可靠性、重復(fù)性[11]。感官評(píng)定法依賴經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期訓(xùn)練、擁有特殊味覺(jué)判別能力的品評(píng)專(zhuān)家來(lái)判斷，很多時(shí)候難以找到適合的人選，且人的感覺(jué)器官在分辨力、敏感度、穩(wěn)定性等方面存在個(gè)體差異并極易受外界因素的干擾[12-14]，儀器評(píng)價(jià)方法則避免了感官評(píng)價(jià)的不足。電子舌是以人類(lèi)味覺(jué)感受機(jī)理為基礎(chǔ)研究開(kāi)發(fā)的一種新型現(xiàn)代化分析檢測(cè)儀器，通 過(guò)傳感器陣列代替生物味覺(jué)味蕾細(xì)胞感測(cè)檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)系統(tǒng)的模式識(shí)別方法得到結(jié)果[15]。本研究利用風(fēng)味酶、活性炭、β-環(huán)狀糊精對(duì)大米蛋白水解液進(jìn)行脫苦，采用電子舌技術(shù)評(píng)價(jià)脫苦效果，并用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法評(píng)價(jià)脫苦前后ACE抑制肽的效果，探討大米蛋白水解物的最佳脫苦工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白（蛋白含量81%） 江西恒天實(shí)業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（2.4 AU/g）、胰蛋白酶（1 250 USP）、風(fēng)味酶（3.0 AU/g） 丹麥Novozymes公司；ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-his-leu hydrate，HHL）、馬尿酸（hippuric acid，Hip） 美國(guó)Sigma化學(xué)公司；活性炭、β-環(huán)狀糊精 碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-5000Z型電子舌 日本Insent公司；1525-2998高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；FA 1104N電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；EMS-8A加熱磁力攪拌器天津市歐諾儀器儀表有限公司；PB-10普及型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius 公司；TGL-205離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；HD-3紫外檢測(cè)器 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大米蛋白的雙酶水解[16]

具體工藝流程：大米蛋白→酶解（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%，堿性蛋白酶加酶量2%（占底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、溫度55 ℃、pH 9.0、酶解時(shí)間120 min；胰蛋白酶加酶量2%、溫度37℃、pH 8.0、酶解時(shí)間30 min）→滅酶（調(diào)節(jié)pH 5.0）→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液→大米蛋白水解液。

1.3.2 大米蛋白水解物的脫苦

1.3.2.1 風(fēng)味酶脫苦單因素試驗(yàn)

風(fēng)味酶控制肽的苦味脫除，有氨肽酶法和羧肽酶法。氨肽酶作用于N端疏水氨基酸，使其水解變成游離的氨基酸；而羧肽酶作用于肽鏈碳端的疏水氨基酸，使其釋放出來(lái)，從而達(dá)到脫苦、去苦的目的[17]。風(fēng)味酶的反應(yīng)最佳溫度為50 ℃，最佳pH值范圍5.0～7.0，故從加酶量、水解時(shí)間和水解pH值3 個(gè)方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)，由于水解后的pH值對(duì)苦味有影響，因此將各處理?xiàng)l件下的大米蛋白水解液pH值統(tǒng)一調(diào)整到7后再通過(guò)電子舌評(píng)價(jià)分別考察3 個(gè)因素對(duì)水解液苦味脫除的影響。

1.3.2.2 風(fēng)味酶脫苦正交試驗(yàn)

通過(guò)電子舌評(píng)價(jià)所確定的單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定3 個(gè)因素的取值水平范圍，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最佳水解條件組合，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 風(fēng)味酶脫苦正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Hydrolysis parameters and levels for orthogonal array design

1.3.2.3 活性炭脫苦單因素試驗(yàn)

活性炭具有豐富的內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)和較高的比表面積，是一種優(yōu)良的吸附材料。其物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸堿，能經(jīng)受水濕、高溫及高壓，不溶于水和有機(jī)溶劑，活性炭對(duì)疏水性氨基酸等的吸附，可使苦味消失，活性炭脫苦法是脫除蛋白水解物苦味最早使用的方法[18]。從活性炭用量、料液pH值、料液溫度及處理時(shí)間4 個(gè)方面進(jìn)行單因素試驗(yàn)，由于水解后的pH值對(duì)苦味有影響，因此將各處理?xiàng)l件下的大米蛋白水解液的pH值統(tǒng)一調(diào)整到7后再通過(guò)電子舌評(píng)價(jià)分別考察4 個(gè)因素對(duì)水解液苦味脫除的影響。

1.3.2.4 活性炭脫苦正交試驗(yàn)

考察活性炭用量、料液pH值、料液溫度及處理時(shí)間對(duì)脫苦效果的影響，選用L9（34）正交試驗(yàn)來(lái)確定最佳脫苦條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 活性炭脫苦正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Active carbon treatment parameters and levels for orthogonal array design

1.3.2.5 β-環(huán)狀糊精脫苦

分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的β-環(huán)狀糊精添加到一定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（肽含量50%）的大米蛋白水解液中，置于50℃水浴鍋，每隔10 min取出50 mL，取8 次，取出后通過(guò)電子舌評(píng)價(jià)分別考察β-環(huán)狀糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)和包埋時(shí)間對(duì)水解液苦味脫除的影響。

1.3.3 苦味的評(píng)價(jià)方法

將1.3.1節(jié)中得到的大米蛋白雙酶水解液作為基準(zhǔn)液，其苦味值定義為0，取70 mL脫苦后的大米蛋白水解液倒入電子舌配備的小塑料杯中，每個(gè)約35 mL作為平行，放入儀器中進(jìn)行測(cè)試，利用苦味傳感器獲得味覺(jué)數(shù)據(jù)結(jié)果，得到其苦味值。電子舌評(píng)價(jià)得到4 組苦味值，由于第1組值穩(wěn)定性較差，故選擇后3組苦味值，取其平均值，得到最終的苦味值。

1.3.4 ACE活性抑制的評(píng)價(jià)[19-20]

采用高效液相色譜法，將HHL溶解在0.05 mol/L pH 8.3的硼酸鹽緩沖液中（含0.3 mol/L氯化鈉），配制成濃度為2.5 mmol/L的HHL溶液。依次加入30 μL的HHL、10 μL不同脫苦條件下的大米蛋白水解液，37 ℃恒溫水浴5 min，然后加入20μL ACE液，恒溫反應(yīng)1 h后加入70 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，得到供試液。取20 μL供試液進(jìn)樣，通過(guò)HPLC圖譜定量馬尿酸的生成量，以馬尿酸的生成量來(lái)計(jì)算樣品的ACE活性抑制率，見(jiàn)下式。

式中：S1為馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；S2為樣品馬尿酸峰面積。

色譜條件：色譜柱Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相A：水（含0.05%三氟乙酸），流動(dòng)相B：乙腈（含0.05% TFA）；梯度洗脫條件：0～15 min：B為10%～60%，15～18 min：B為60%～10%；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味酶脫苦苦味評(píng)分

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，當(dāng)加酶量為2.5%時(shí)水解液的苦味值最低，故選擇加酶量為2.5%；隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解液的脫苦效果反而不理想，在水解時(shí)間為0.5 h時(shí)苦味值較低，故選擇水解時(shí)間為0.5 h；水解pH值為6.0時(shí)，苦味值最低，故選擇水解pH值為6.0，正交試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上確定因素水平范圍。

表3 風(fēng)味酶脫苦電子舌評(píng)定結(jié)果Table 3 Evaluation of the debittering efficiency of flavourzyme by one-factor-at-a-time dessiiggnn

2.1.2 風(fēng)味酶脫苦電子舌法正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 風(fēng)味酶脫苦電子舌法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results for debittering with flavourzyme yme

由表4極差分析可知，采用電子舌評(píng)價(jià)方法，酶解條件對(duì)風(fēng)味酶法脫苦的影響依次為水解pH值＞水解時(shí)間＞加酶量，得到最優(yōu)方案為加酶量2.5%、水解時(shí)間20 min、水解pH 5.8，將此最優(yōu)方案與正交表中苦味值最低的第1號(hào)試驗(yàn)作對(duì)比試驗(yàn)，在該條件下大米肽的苦味值為－5.1，優(yōu)于第1號(hào)試驗(yàn)，故風(fēng)味酶法脫苦的最佳處理?xiàng)l件為加酶量2.5%、水解時(shí)間20 min、水解pH 5.8。

2.2 活性炭脫苦的苦味評(píng)分

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

表5 活性炭脫苦電子舌評(píng)定結(jié)果Table 5 Evaluation of the debittering efficiency of active carbon by one-factor-at-a-time dessiiggnn

由表5可以看出，在活性炭用量2%、處理時(shí)間20 min、料液pH 7時(shí)苦味值最低；隨著料液溫度的升高，苦味值降低，在65 ℃時(shí)，苦味值最低，但如再升高料液溫度，可能會(huì)影響大米肽的活性，故選擇料液溫度為65℃，正交試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上確定因素水平范圍。

2.2.2 活性炭脫苦電子舌法正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 活性炭脫苦電子舌法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Orthogonal array design and results for debittering with activated carrbboonn

由表6極差分析可知，采用電子舌評(píng)價(jià)方法，反應(yīng)條件對(duì)活性炭脫苦的影響依次為活性炭用量＞料液溫度＞處理時(shí)間＞料液pH值，得到最優(yōu)方案活性炭用量2.0%、料液溫度60℃、處理時(shí)間20 min、料液pH 7.0，將此最優(yōu)方案與正交表中最好的第5號(hào)試驗(yàn)作對(duì)比實(shí)驗(yàn)，在該條件下大米肽的苦味值為－5.2，優(yōu)于第5號(hào)試驗(yàn)，故活性炭脫苦的最佳處理?xiàng)l件為活性炭用量2.0%、料液溫度60℃、處理時(shí)間20 min、料液pH 7.0。

2.3 β-環(huán)狀糊精脫苦試驗(yàn)苦味評(píng)分

通過(guò)電子舌評(píng)價(jià)分別考察β-環(huán)狀糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)和包埋時(shí)間對(duì)水解液苦味脫除的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 1 β-環(huán)狀糊精脫苦實(shí)驗(yàn)電子舌評(píng)價(jià)Fig.1 Evaluation of the debittering efficiency of β-cyclodextrin by one-factor-at-a-time design

由圖1可以看出，隨著β-環(huán)狀糊精添加量的增加，大米肽的苦味值降低，由于電子舌不能辨別出糊口感，其檢測(cè)出的各質(zhì)量分?jǐn)?shù)β-環(huán)狀糊精的脫苦效果均有差異，故選擇β-環(huán)狀糊精添加量為10%；包埋30 min后，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)β-環(huán)狀糊精的苦味值已基本沒(méi)有變化，苦味基本脫除，故選擇包埋時(shí)間為30 min。

2.4 不同脫苦方法對(duì)大米肽ACE抑制活性的影響

2.4.1 風(fēng)味酶法脫苦對(duì)大米肽ACE抑制率的影響

通過(guò)測(cè)定大米蛋白雙酶水解液及經(jīng)風(fēng)味酶法脫苦處理的典型試樣1、4、8號(hào)ACE抑制率，考察該脫苦工藝對(duì)大米蛋白水解物ACE抑制活性的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 電子舌評(píng)價(jià)典型試樣ACE抑制率Fig.2 ACE inhibitory activity of rice protein hydrolyzates debittered with flavourzyme

由圖2可知，經(jīng)風(fēng)味酶脫苦后的3 個(gè)典型試樣相對(duì)于未脫苦的大米蛋白水解液其ACE抑制率僅試樣1有顯著降低，試樣4和試樣8沒(méi)有顯著變化，且電子舌評(píng)價(jià)典型試樣4的ACE抑制率相對(duì)最高。

2.4.2 活性炭脫苦對(duì)大米肽ACE抑制活性的影響

通過(guò)測(cè)定大米蛋白雙酶水解液及經(jīng)活性炭脫苦處理典型試樣2、5、6號(hào)的ACE抑制率，考察該脫苦工藝對(duì)大米蛋白水解物ACE抑制活性的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 電子舌評(píng)價(jià)典型試樣ACE抑制率Fig.3 ACE inhibitory activity of rice protein hydrolyzates debittered with active carbon

由圖3可知，經(jīng)活性炭脫苦后的大米蛋白水解液的ACE抑制率與未經(jīng)脫苦的大米蛋白雙酶水解物相比都有很大程度的下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其ACE抑制率相對(duì)原液均有顯著下降?；钚蕴繉?duì)疏水性氨基酸等的吸附，使苦味的消失常伴隨著營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的下降[21]。

3 討 論

本研究利用風(fēng)味酶、活性炭、β-環(huán)狀糊精對(duì)大米蛋白水解液進(jìn)行脫苦，采用電子舌技術(shù)評(píng)價(jià)脫苦效果，并用HPLC法評(píng)價(jià)脫苦前后的水解物對(duì)ACE的抑制活性，探討大米蛋白水解物的最佳脫苦工藝。結(jié)果表明，風(fēng)味酶法脫苦的最佳處理?xiàng)l件為加酶量2.5%、水解時(shí)間20 min、水解pH 5.8；活性炭脫苦的最佳處理?xiàng)l件為活性炭用量2.0%、料液溫度60 ℃、處理時(shí)間20 min、料液pH 7.0；β-環(huán)狀糊精脫苦的最佳處理?xiàng)l件為β-環(huán)狀糊精添加量10%、包埋時(shí)間30 min。

ACE能夠調(diào)節(jié)血壓，在預(yù)防高血壓中，ACE活性的抑制率是一個(gè)重要的指標(biāo)[22]。風(fēng)味酶法脫苦的幾個(gè)典型試樣的ACE抑制率相比未脫苦的大米蛋白水解液略有降低；而活性炭脫苦法雖有很好的脫苦效果，但其幾個(gè)典型試樣的ACE抑制率相比未脫苦的大米蛋白水解液有顯著降低；這主要是由于活性炭是表面吸附劑，對(duì)苦味肽吸附的同時(shí)也吸附了其他的肽氨基酸等[23]；由于β-環(huán)狀糊精將肽包合，無(wú)法測(cè)定其對(duì)ACE抑制活性的影響，理論上說(shuō)該法不會(huì)造成氮損失，在消化過(guò)程中被包合的肽可釋放出來(lái)[24-25]。這3 種方法都有較好的脫苦效果，但β-環(huán)狀糊精脫苦法無(wú)法測(cè)定其對(duì)ACE抑制活性的影響，若從考慮原料的利用率來(lái)說(shuō)，可選擇活性炭脫苦法，因?yàn)榛钚蕴靠梢曰厥赵倮茫一钚蕴棵摽嗖僮鞅容^簡(jiǎn)單；若從營(yíng)養(yǎng)與安全的角度考慮，可選擇風(fēng)味酶法脫苦，因?yàn)槠涿摽嘈Ч们褹CE抑制率基本沒(méi)有顯著變化[26-27]。

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Using Electronic Tongue to Evaluate the Effect of ACE Inhibitory Peptide Enrichment on Debittering Rice Protein Hydrolyzate

HU Qin-ling, ZHENG Liang-qing, WANG Shen, YI Qing, WU Yong-ning, GONG Zhi-yong*
(Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

This work was executed to explore the best debittering process for rice protein hydrolysate by separately using fl avourzyme, active carbon and β-cyclodextrin. The debittering effi ciency was measured by means of electronic tongue (ET) and the angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of rice protein hydrolysate before and after debittering was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that the optimal debittering conditions were hydrolysis at an initial pH of 5.8 for 20 min with 2.5% of fl avourzyme, treatment at 60 ℃ for 20 min with 2.0% of active carbon or embedding for 30 min with 10% of β-cyclodextrin.

ACE inhibitory peptides; debittering; electronic tongue; fl avourzyme; active carbon; β-cyclodextrin

TS252.4

A

1002-6630（2014）24-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201424005

2014-06-22

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2010AA023003）；武漢輕工大學(xué)校研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（2013cx018）

胡勤玲（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：huqinling1029@163.com

*通信作者：宮智勇（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：gongzycn@163.com