潘會君，莫小輝，馮彥軍，陳中建，陳 松，秦路平（.上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海 00；.第二軍醫(yī)大學藥學院生藥教研室，上海 00；.上海市皮膚病醫(yī)院中心實驗室，上海 00；.蘇州市第五人民醫(yī)院，江蘇蘇州 5000）

據(jù)預測2000－2050年，全球癌癥新發(fā)患者將以每年2倍的速度遞增，治療費用在未來10年將增加800億美元[1]，為改善腫瘤治療現(xiàn)狀，各國以及各大制藥公司都在加大開發(fā)腫瘤藥物的研發(fā)力度。自1971年Judan Folkman首次提出“腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成”的假說以來[2]，血管生成在腫瘤發(fā)展過程中的作用逐漸明朗。Douglas Hanahan和Robert A.Weinberg先后撰文描述腫瘤特征，將血管生成（Sustained Angiogenesis）學說明確提出[3]，揭示了血管生成在腫瘤生長中的重要地位。

知母皂苷AⅢ為中藥知母中甾體皂苷類成分，近年來發(fā)現(xiàn)其對部分腫瘤細胞有很好的抑制作用：（1）通過線粒體介導誘發(fā)Hela腫瘤細胞凋亡[4]；（2）通過自噬機制抑制Hela腫瘤細胞生長[5]；（3）誘導人乳腺癌細胞BT474凋亡[6]；（4）誘導人結腸癌HCT-15細胞凋亡和阻止細胞周期；（5）抑制HCT-15細胞移植瘤動物模型的腫瘤生長[7]。

本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），觀察知母皂苷AⅢ對內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響，為研究其抗血管作用提供前期數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

HF90/HF240型CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；40R型低溫高速離心機（美國Thermo Scientific公司）；EPICS XL分析型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ELX800NB型酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 藥品與試劑

知母皂苷AⅢ（上海同田生物技術股份有限公司，批號：070503，純度：≥98%）；MTT（美國Sigma公司）；RPMI Medium 1640、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡測試盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 細胞株

HUVEC由蘇州市第五人民醫(yī)院馮彥軍醫(yī)師饋贈。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HUVECs于37 ℃下，在5%CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

2.2 MTT比色法檢測細胞生長

收集對數(shù)期細胞，接種于96孔板，細胞密度為5 000/孔。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁24 h后，加入0（即空白對照）、1、2、4、8 μmol/L濃度的知母皂苷AⅢ，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490 nm波長處測定吸光度（A），計算細胞生長抑制率（%）。細胞生長抑制率（%）＝（空白對照A－用藥A）/空白對照A×100%。

2.3 細胞形態(tài)學觀察

收集對數(shù)期細胞，接種細胞于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁24 h后，加入0、1、2、4、8 μmol/L濃度的知母皂苷AⅢ，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

2.4 流式細胞儀檢測凋亡細胞

收集對數(shù)生長期細胞，接種于24孔板，分別加入0、4、8 μmol/L藥物作用24 h后收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞2次，用500 μl結合緩沖液重懸細胞，加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl，混勻于室溫避光孵育15 min，收集到流式管中，流式細胞儀檢測細胞凋亡程度。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 知母皂苷AⅢ對HUVECs生長的抑制作用

終濃度分別為1、2、4、8 μmol/L的知母皂苷AⅢ作用HUVECs 24、48、72 h，細胞生長受到抑制，并與時間、濃度呈正比。計算可知，知母皂苷AⅢ作用HUVECs 24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為7.2、4.0、2.0 μmol/L。知母皂苷AⅢ對HUVECs生長的抑制作用見表1。

表1 知母皂苷AⅢ對HUVECs生長的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitin of timosaponin AⅢon the proliferation of HUVECs（，n＝3）

表1 知母皂苷AⅢ對HUVECs生長的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitin of timosaponin AⅢon the proliferation of HUVECs（，n＝3）

與0 μmol/L比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.0 μmol/L：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.2 知母皂苷AⅢ對HUVECs細胞形態(tài)的影響

低倍鏡（100×）可見，8 μ mol/L知母皂苷A Ⅲ處理HUVECs 24、48、72 h后細胞逐漸固縮，細胞減少。高倍鏡（400×）可見，2 μmol/L知母皂苷處理AⅢHUVECs 24 h后逐漸出現(xiàn)空泡，4、8 μmol/L知母皂苷AⅢ處理HUVECs明顯出現(xiàn)空泡。知母皂苷AⅢ對HUVECs細胞形態(tài)的影響見圖1。

3.3 知母皂苷AⅢ對HUVECs凋亡的促進作用

知母皂苷AⅢ作用于HUVECs 24 h，其IC50為7.17 μmol/L，因此本研究選用接近IC50和2 IC50，即4、8 μmol/L知母皂苷AⅢ。與0 μmol/L比較，8 μmol/L濃度下知母皂苷AⅢ可明顯提高HUVEC凋亡率（P＜0.05）。流式細胞儀檢測結果見圖2[圖中左下象限顯示活細胞（LL：Annexin Ⅴ－/PI－）；右下象限為早期凋亡細胞（LR：Annexin Ⅴ+/PI－）；右上象限為晚期凋亡細胞（UR：Annexin Ⅴ+/PI+）；而左上象限是非活細胞，即壞死細胞（UL：Annexin Ⅴ－/PI+）。凋亡細胞為右上象+右下象]；知母皂苷AⅢ對HUVECs凋亡的影響見表2。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，知母皂苷AⅢ對體外培養(yǎng)HUVECs有明顯抑制作用，細胞形態(tài)學觀察也證明了這一點。高倍鏡下可見從知母皂苷AⅢ2 μmol/L開始HUVECs即出現(xiàn)空泡，隨著濃度的加大，空泡逐漸明顯。李梢等[8-9]采用網(wǎng)絡藥理學方法發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ可能具有抗血管作用，并采用VEGF刺激內(nèi)皮細胞過度增殖，發(fā)現(xiàn)其具有抑制作用，與本研究直接采用HUVECs觀察到相同的現(xiàn)象，提示其抗血管作用可能不完全依賴血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），但尚需進一步實驗驗證。

已有研究顯示，知母皂苷AⅢ能促進腫瘤細胞凋亡，但其抑制VEGF增殖的作用與促進細胞凋亡是否有關？為了驗證此想法，筆者采用流式細胞儀檢測其對HUVECs凋亡的影響，選用接近IC50和2 IC50，即4、8 μ mol/L知 母皂苷A Ⅲ作 用HUVECs 24 h后檢測細胞凋亡。結果顯示，知母皂苷AⅢ能誘導部分HUVECs凋亡，可初步推測其抑制內(nèi)皮細胞增殖與誘導凋亡有關。

圖1 知母皂苷AⅢ對HUVECs細胞形態(tài)的影響A.作用24、48、72 h（100×）；B.作用24 h（400×，箭頭為細胞空泡）Fig 1 Effect of timosaponin AⅢon morphology of HUVECsA.treated for 24 h，48 h and 72 h（100×）；B.treated for 24 h（400×，arrowhead means cell vacuoles）

圖2 流式細胞儀檢測結果A.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.8 μmol/LFig 2 Results of flow cytometry testA.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.8 μmol/L

正常成人除了創(chuàng)傷愈合及生殖周期外，幾乎所有新生血管生成都是病理性的，如腫瘤、風濕性關節(jié)炎、糖尿病及視網(wǎng)膜病變等[10]。筆者推測知母皂苷AⅢ對內(nèi)皮系統(tǒng)的抑制作用有可能是其對血管增生性疾病具有廣譜對抗作用。下一步需要加強血管增生性疾病動物模型及相關血管生成分子靶點的研究，以驗證該假說。

表2 知母皂苷AⅢ對HUVECs凋亡的影響（，n＝3）Tab 2 Effect of timosaponin A Ⅲon the apoptosis of HUVECs（，n＝3）

表2 知母皂苷AⅢ對HUVECs凋亡的影響（，n＝3）Tab 2 Effect of timosaponin A Ⅲon the apoptosis of HUVECs（，n＝3）

與0 μmol/L比較：＊P＜0.05vs.0 μmol/L：＊P＜0.05

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