陳曉明，莫小林，韋振源，龔敏陽，陳 朝（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

十一方藥酒（批準(zhǔn)文號：桂藥制字Z01060025）為我院制劑室的自制品種，由三七、重樓、大黃、紅花、煅自然銅、乳香、秦艽、沒藥、續(xù)斷、制馬錢子等中藥組成，臨床用于治療跌打扭傷，各種骨折、骨傷、風(fēng)濕骨痛等癥，療效顯著。目前，較常用的酒劑制備方法為浸漬法、滲漉法、回流提取法或其他適宜方法[1]。近年來，越來越多的學(xué)者利用超聲波技術(shù)提取中藥制劑[2-5]，該法具有處理時間短、提取效率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究采用單因素試驗(yàn)初步考察了超聲波法提取十一方藥酒的工藝參數(shù)，并以白酒體積分?jǐn)?shù)、白酒用量、提取時間與提取次數(shù)為考察因素，以十一方藥酒總固體量、人參皂苷Rg1與大黃酚含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法考察超聲波提取十一方藥酒的方法，以為十一方藥酒的制備工藝選擇提供科研依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DCU-20A5型高效液相色譜儀、SPD-20A型紫外檢測儀（日本島津公司）；GH-252型電子分析天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；CD-UPT-II-10L型超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）；KQ3200E型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201027）、大黃酚對照品（批號：110796-201118）均購自中國食品藥品檢定研究院；十一方藥酒（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，批號：20130507、20130523、20130611，規(guī)格：100 ml/瓶）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1含量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸水溶液（22∶78，V/V）；檢測波長：205 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。在此條件下人參皂苷Rg1可與其他峰完全分離，保留時間約為22.6 min，理論板數(shù)不低于5 000。

2.1.2 溶液的制備（1）對照品溶液的制備。精密稱取2.0 mg人參皂苷Rg1對照品，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含0.20 mg人參皂苷Rg1的對照品溶液。（2）供試品溶液的制備。精密吸取3.0 ml十一方藥酒，水浴蒸干至無醇味，加15 ml水溶解，濾過，濾液用乙醚萃取2次，每次10 ml，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇萃取3次，每次8 ml，合并正丁醇液，超聲處理30 min，用5%NaOH溶液洗滌2次，每次10 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解于25 ml量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取人參皂苷Rg1對照品溶液0.4、1.0、1.8、2.6、3.4 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇定容，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣3次。以人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝1 390.2x+831.7（r＝0.99 80）。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度在8.0～68.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2 大黃酚含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（84 ∶16，V/V）；檢測波長254 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。在此條件下大黃酚可與其他峰完全分離，保留時間約為13.7 min，理論板數(shù)不低于6 000。

2.2.2 溶液的制備（1）對照品溶液的制備。精密稱取大黃酚對照品0.205 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含20.5 μg大黃酚的對照品溶液；（2）供試品溶液的制備。精密吸取3.0 ml十一方藥酒，水浴蒸干至無醇味，加入20 ml 10%鹽酸溶液，超聲處理30 min，用氯仿溶液萃取3次，每次10 ml，合并氯仿溶液，加2%碳酸鈉溶液洗滌，棄去碳酸鈉液層，氯仿層用20 ml水洗滌，棄去水層，氯仿層水浴揮干，用甲醇定容于10 ml量瓶中，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取0.1、0.3、0.8、1.4、2.0 ml大黃酚對照品溶液，置5 ml量瓶中，用甲醇定容，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以大黃酚質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝77 726x+7 175.1（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，大黃酚質(zhì)量濃度在0.41～8.20 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3 總固體量的測定

精密量取各樣品溶液50 ml，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算總固體量[7]。

2.4 超聲波提取條件對提取效果的影響

2.4.1 浸泡時間考察 在一定條件下，先將十一方藥酒原料藥材用溶劑浸泡不同時間后超聲波（150 W，40 kHz）提取，分別測定人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。藥材浸泡2 h所測得人參皂苷Rg1含量、大黃酚含量與總固體量均最高；3 h后隨浸泡時間的延長，各含量有所下降。結(jié)果表明，在超聲波提取前選擇浸泡2 h即可。不同浸泡時間對十一方藥酒提取效果的影響見表1。

2.4.2 藥材粉碎度考察 在成藥的制備過程中，中藥有效成分的浸出常常與擴(kuò)散面積（粉碎度）和擴(kuò)散時間有關(guān)[8]。在超聲波提取前先將十一方藥酒原料藥材粉碎成不同的粒度，分別測定不同粉碎度下超聲波提取后藥酒中人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。藥材粉碎成最粗粉時人參皂苷Rg1、大黃酚含量最高，總固體量接近高值。結(jié)果表明，超聲波提取前藥材粉碎成最粗粉（10目）為宜。不同粉碎度對十一方藥酒提取效果的影響見表2。

表2 不同粉碎度對十一方藥酒提取效果的影響Tab 2 Effect of different grinding degree on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.3 白酒體積分?jǐn)?shù)考察 在一定條件下，分別用45%、50%、60%、70%白酒超聲波提取樣品。在其他條件不變的情況下，50%白酒提取得到的各成分含量均最高，60%與70%白酒提取得到的各成分含量有所下降。結(jié)果表明，白酒體積分?jǐn)?shù)以50%為宜。不同體積分?jǐn)?shù)白酒對十一方藥酒提取效果的影響見表3。

表3 不同白酒體積分?jǐn)?shù)對十一方藥酒提取效果的影響Tab 3 Effect of different liquor concentration on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.4 料液比考察 十一方藥酒不同料液比測定人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。料液比在1 ∶5（g/ml）時，人參皂苷Rg1含量、大黃酚含量與總固體量均最高，當(dāng)料液比超過1∶5（g/ml）時，各成分含量有所下降。結(jié)果表明，選擇料液比1 ∶5（g/ml）較為合適。不同料液比對十一方藥酒提取效果的影響見表4。

表4 不同料液比對十一方藥酒提取效果的影響Tab 4 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.5 超聲提取時間考察 在一定條件下，分別對十一方藥酒進(jìn)行45、60、75、90 min的超聲提取。結(jié)果表明，在60 min時，人參皂苷Rg1、大黃酚的含量及總固體量為最高，超聲時間延長其含量反而有所降低。不同超聲提取時間對十方藥酒提取效果的影響見表5。

2.4.6 提取次數(shù)考察 在一定條件下，測定十一方藥酒不同提取次數(shù)人參皂苷Rg1、大黃酚的含量與總固體量。結(jié)果表明，超聲波提取1次時人參皂苷Rg1、大黃酚的含量為最高，總固體量與提取2次接近。說明超聲波提取1次已基本提取完全，從經(jīng)濟(jì)、時間、效率等綜合考慮，選擇提取次數(shù)為1次較為合適。不同提取次數(shù)對十一方藥酒提取效果的影響見表6。

表5 不同超聲提取時間對十一方藥酒提取效果的影響Tab 5 Effect of different extraction time on the extraction of Shiyifang vinum

表6 不同提取次數(shù)對十一方藥酒提取效果的影響Tab 6 Effect of different extraction times on the extraction of Shiyifang vinum

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，單因素試驗(yàn)的優(yōu)化條件為藥材粉碎成最粗粉（10目），浸泡2 h，白酒體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶5（g/ml），提取時間為60 min，提取次數(shù)為1次。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選超聲提取最佳工藝條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量為考察指標(biāo)，白酒體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。中藥有效成分是中藥復(fù)方發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，而總固體量影響制劑澄清度和成品穩(wěn)定性。故選擇人參皂苷Rg1、大黃酚作為評價指標(biāo)權(quán)重系數(shù)均為0.4，總固體量作為評價指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為0.2，得到綜合評分。因素水平見表7；正交試驗(yàn)結(jié)果見表8；方差分析結(jié)果見表9。

表7 因素與水平Tab 7 Factors and levels

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 8 Results of orthogonal experiment

表9 方差分析結(jié)果Tab 9 Results of variance analysis

由表8、表9可知，影響十一方藥酒超聲波提取效果的因素順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即白酒體積分?jǐn)?shù)＞提取時間＞提取次數(shù)＞料液比。其中，因素A對試驗(yàn)結(jié)果有非常顯著性影響；因素C對試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。結(jié)合溶劑回收、節(jié)約時間等因素，最終確定超聲波提取最優(yōu)工藝條件為A2B2C3D1，即料液比（1 ∶5）g/ml，50%白酒超聲波提取1次，時間為75 min，這與前述單因素試驗(yàn)結(jié)果比較基本一致。

2.6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按超聲波提取最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，測定人參皂苷Rg1、大黃酚含量與總固體量。使用最佳驗(yàn)證工藝參數(shù)，人參皂苷Rg1含量平均為0.445 mg/ml，RSD＝0.70%；大黃酚含量平均為22.10 μg/ml，RSD＝1.53%；總固體量均值為1.604 7 g，RSD＝0.71%。以上數(shù)據(jù)接近正交試驗(yàn)結(jié)果的最高值，說明正交試驗(yàn)結(jié)果可靠。

3 討論

我院十一方藥酒的制備方法為浸漬法，即將組方藥物粉碎成粗粉，用50 ℃白酒密閉浸泡6個月，定期攪拌，濾過，灌裝，用于院內(nèi)臨床使用，并獲得了醫(yī)院制劑批準(zhǔn)文號（桂藥制字Z01060025）。該法具有生產(chǎn)周期長，溶劑揮發(fā)較多，藥液損耗大等缺點(diǎn)。方中三七、大黃為君藥，三七有效成分為皂苷類，其中以人參皂苷Rg1等成分含量最高[10]。大黃具有清熱瀉下、抗菌、行淤化積、消炎止血、抗腫瘤等功效[11]。筆者已對浸漬法和回流法提取十一方藥酒中人參皂苷Rg1的含量進(jìn)行了測定[12-13]并與超聲波提取進(jìn)行比較。結(jié)果，超聲波提取十一方藥酒中的人參皂苷Rg1的含量較回流法高，較浸漬法高出2倍，且不需加熱，減少了揮發(fā)性成分的損耗，提取時間也大大減少，只需75 min。

在超聲提取時，為了避免白酒損失，用具塞三角燒瓶進(jìn)行提取。測定人參皂苷Rg1時分別對乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液[14]、甲醇-水[15]等不同流動相及流動相的不同比例進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸水溶液（22 ∶78，V/V）作流動相時人參皂苷Rg1分離效果最好。在人參皂苷Rg1供試品溶液的制備中，還考察了不用堿洗、不同堿洗和堿洗濃度和次數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%NaOH溶液洗2次，人參皂苷Rg1分離效果最好和含量最高。

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