肖佩玉，萬正蘭，黃際薇（1.中山大學附屬第三醫(yī)院藥劑科，廣州 510630；.中山大學附屬第五醫(yī)院藥學部，廣東珠海 510630）

原發(fā)性肝癌炎癥危害人類生命健康，我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，每年死于肝癌的患者超過11萬[1]。由于該疾病早期臨床癥狀不典型，患者發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)已屬晚期，失去了手術(shù)治療最佳時機，因此患者病死率極高，預后效果較差[2]。晚期肝癌患者臨床常用的治療方法為放化療，但放化療的毒副作用較大，導致部分患者不耐受而影響治療效果。枸杞多糖是從枸杞子中提煉出來的蛋白多糖，近代藥理學研究指出，枸杞多糖具有抗基因突變、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫力、抵抗病毒及感染等多種生物活性功能[2]。枸杞多糖不僅能直接殺死腫瘤細胞，同時可與中間宿主產(chǎn)生生物學效應，通過多途徑作用于免疫細胞，增加抗體分泌，提高機體免疫功能，從而起到殺滅及抑制腫瘤細胞的作用[3]。為此，本研究通過復制H22肝癌小鼠模型，以探討枸杞多糖抑制腫瘤與提高機體免疫力的作用。

1 材料

1.1 儀器

BLXK-JA3003B型電子天平（上海鑫倉電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

枸杞多糖（西安森冉生物工程有限公司，批號：20081201，含量：＞30%）；環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：20090103）；甲胎蛋白（AFP）測試盒（北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司）；鐵蛋白（SF）、癌胚抗原（CEA）測試盒（天津中新科炬生物制藥有限公司）；白細胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子（TNF）-α、γ干擾素（INF-γ）酶聯(lián)免疫（ELISA）測試盒均購于上海森雄科技實業(yè)有限公司。

1.3 動物與瘤株

2 方法

2.1 模型的復制

將經(jīng)三代細胞傳代培養(yǎng)的H22瘤株經(jīng)腹腔接種到KM小鼠體內(nèi)，并于接種后7 d選擇腹水飽滿、精神狀態(tài)良好的小鼠采用頸椎脫臼處死，消毒腹腔部位后抽取小鼠腹部乳白色腹水作為腫瘤源，并用無菌生理鹽水將腫瘤細胞懸液稀釋為原來的3倍，經(jīng)常規(guī)消毒后將0.2 ml懸液皮下接種于小鼠右前肢腋窩，以復制小鼠肝癌模型。

2.2 分組與給藥

20只KM小鼠隨機均分為4組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、環(huán)磷酰胺（20 mg/kg）組、枸杞多糖（5 mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)10 d。

2.3 指標的檢測

2.3.1 體質(zhì)量的稱定 每天上午8：00～10：00稱取小鼠去除瘤體后的純體質(zhì)量。

2.3.2 抑瘤率的計算 稱定腫瘤質(zhì)量，并根據(jù)公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）＝[1－（用藥組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量）]×100%。

2.3.3 血清腫瘤標記物的測定 空腹靜脈抽取小鼠血液3 ml，常規(guī)離心得血清，采用ELISA法測定血清腫瘤標記物。

2.3.4 炎癥因子的測定 空腹靜脈抽取小鼠血液3 ml，常規(guī)離心得血清，采用ELISA法測定小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量。

2.3.5 自然殺傷（NK）細胞活性的測定 采用MTT法測定NK細胞活性。NK細胞活性（%）＝[靶細胞吸光度－（用藥組吸光度－效應細胞吸光度）]/靶細胞吸光度×100%。其中，效應細胞為脫頸椎處死小鼠去脾臟研磨制成單細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，Hanks液洗3次，用RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)在95%以上，并調(diào)整細胞密度為5×106ml－1；靶細胞為將連續(xù)傳代培養(yǎng)的胞株為靶細胞，活細胞數(shù)在95%以上、細胞密度調(diào)為2.5×105ml－1。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 枸杞多糖對模型小鼠體質(zhì)量的影響

給藥第5、10天，與正常對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠體質(zhì)量的影響見表1。

表1 枸杞多糖對模型小鼠體質(zhì)量的影響（）Tab 1 Effects ofL.chinensis polysaccharides on body weight in model rats（）

表1 枸杞多糖對模型小鼠體質(zhì)量的影響（）Tab 1 Effects ofL.chinensis polysaccharides on body weight in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.2 枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠瘤質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠瘤質(zhì)量減少（抑瘤率為62.98%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響見表2。

表2 枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響（）Tab 2 Effects ofL.chinensis polysaccharides on tumor inhibition rate in model rats（）

表2 枸杞多糖對模型小鼠抑瘤率的影響（）Tab 2 Effects ofL.chinensis polysaccharides on tumor inhibition rate in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.3 枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清AFP、CEA含量增加，SF含量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠血清AFP、CEA含量減少，SF含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響見表3。

表3 枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響（）Tab 3 Effects ofL.chinensis polysaccharides on serum tumor markers in model rats（）

表3 枸杞多糖對模型小鼠血清腫瘤標記物水平的影響（）Tab 3 Effects ofL.chinensis polysaccharides on serum tumor markers in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.4 枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量減少，TNF-α含量增加，NK細胞活性減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，枸杞多糖組小鼠血清IL-2、IFN-γ含量增加，TNF-α含量減少，NK細胞活性增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響見表4。

表4 枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響（）Tab 4 Effects ofL.chinensis polysaccharides on inflammatory cytokines levels in model rats（）

表4 枸杞多糖對模型小鼠血清細胞因子水平的影響（）Tab 4 Effects ofL.chinensis polysaccharides on inflammatory cytokines levels in model rats（）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展是非常復雜的過程，目前關(guān)于腫瘤的作用機制還有待進一步研究，但已有研究指出，腫瘤的發(fā)生、進展、預后與機體免疫狀況有密切關(guān)系，腫瘤患者普遍存在免疫功能低下的情況[4]。機體免疫狀況對對抗腫瘤侵襲、抑制腫瘤生長具有重要意義。

枸杞多糖是從植物枸杞子中提煉的活性成分，相關(guān)研究表明，其具有抗病毒、調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤、降血糖血脂、清除機體自由基與延緩衰老等功能[5]。枸杞多糖對機體免疫功能的調(diào)節(jié)，能通過與中間宿主產(chǎn)生生物學效應而起到間接抑制或殺傷腫瘤的目的[6]。枸杞多糖可通過多層面及多途徑調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，從而激活巨噬細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞等免疫細胞而起到免疫調(diào)節(jié)功能。此外，枸杞多糖能通過刺激NK細胞大量分泌IFN-γ，增加巨噬細胞免疫殺傷功能，調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)，增強機體抗腫瘤作用[7-8]。

本研究中對H22肝癌小鼠ig枸杞多糖，通過研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖具有明顯抑制腫瘤的作用。枸杞多糖組小鼠平均瘤質(zhì)量低于模型組，而抑瘤率則高于環(huán)磷酰胺組，環(huán)磷酰胺作為廣譜抗癌藥物具有較強的抑制腫瘤作用，但其在殺傷癌癥細胞的同時也會對機體正常細胞產(chǎn)生較大的損害作用，增加患者不良反應率。蔣艷等[9]研究指出，通過檢查腫瘤血清標記物可以有效評價藥物抑瘤作用。CEA是由腸黏膜釋放的，進入循環(huán)后其將會被肝臟吸收并分解，當肝臟受損時，CEA的分解能力將受到影響，從而導致血液中CEA的水平上升[10]。SF是血清中的鐵蛋白質(zhì)，其生成及合成是由肝臟細胞生成的，當肝臟細胞受損時，會導致鐵蛋白的合成受阻，使得血液中SF含量升高。AFP是肝組織出現(xiàn)大規(guī)模壞死后釋放到血清中的物質(zhì)，因此通過對三種標記物進行測定能有效預測肝癌的進展程度。本研究枸杞多糖組小鼠血清AFP、CEA低于模型組，而SF高于模型組，從而說明枸杞多糖能有效抑制腫瘤生長。鄧自輝等[11]研究認為，腫瘤的發(fā)生與機體免疫力失衡有關(guān)，通過增強機體免疫力可有效抵抗腫瘤。本研究枸杞多糖組NK細胞活性、IL-2、INF-γ含量高于環(huán)磷酰胺組，而TNF-α含量低于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其結(jié)果與楊書良等[12]報導一致。原因可能與枸杞多糖如下作用機制有關(guān)：（1）增加T淋巴細胞及淋巴細菌亞群，增強淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。（2）通過調(diào)節(jié)小鼠巨噬細胞，釋放可溶性因素及抗原從而起到抑制腫瘤的作用。（3）枸杞多糖刺激NK細胞釋放，增加NK細胞殺傷腫瘤活性，溶解腫瘤細胞，增加白細胞，降低IL，誘導干擾素生成，促進腫瘤細胞與巨噬細胞結(jié)合，從而產(chǎn)生特異性免疫殺傷腫瘤細胞，起到抑制腫瘤的作用。

[1]張鳴號，王秀玉，王秀梅，等.枸杞多糖對小鼠移植性肝癌抑制作用的實驗研究[J].中草藥，2012，（6）：1 142.

[2]周愛國，李小蘭.枸杞多糖對大鼠小腸缺血再灌注氧化應激的抑制作用[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（22）：221.

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[4]佘燕玲，何彥麗，杜標炎，等.枸杞多糖聯(lián)合趨化因子對肝癌小鼠T輔助淋巴細胞分化的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（7）：208.

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[6]成日華，李煥德.枸杞多糖抗腫瘤機制研究進展[J].中南藥學，2011，9（12）：921.

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[10]章培軍，邢雁霞，劉斌鈺，等.枸杞多糖對實驗性肝損傷保護作用的研究[J].中國藥物與臨床，2011，11（11）：1 286.

[11]鄧自輝，牛陽，王榮，等.枸杞多糖藥理作用的研究現(xiàn)狀[J].臨床合理用藥雜志，2011，04（35）：164.

[12]楊書良，郝玉栓，單鐵英，等.口服枸杞多糖對實驗性食管癌大鼠免疫功能影響的研究[J].中國實驗診斷學，2012，16（6）：986.