王巧云，李丙華，朱 莉，李 萍，韓志武#（1.青島大學(xué)藥學(xué)院，山東青島 66071；.青島市第八人民醫(yī)院藥劑科，山東青島 66100；.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東青島 6600）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）發(fā)生于全身動脈系統(tǒng)，近年來其發(fā)病率日益上升[1]。Ross提出AS是一種炎癥性疾病，探討藥物對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，成為國內(nèi)外AS研究的熱點[2]。

齊墩果酸（Oleanic acid）是一種從天然產(chǎn)物中提取的五環(huán)三萜類化合物[3]。近十年來，齊墩果酸對心血管疾病的保護(hù)作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。Somova LI[4]等發(fā)現(xiàn)齊墩果酸具有抗AS的作用。Sultana N[5]報道了齊墩果酸的心血管保護(hù)作用，與其自身所具有不飽和基團(tuán)清除活性氧、提高抗氧化酶的活性有關(guān)。但是，齊墩果酸抗AS的具體機(jī)制仍有待探索。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，尤其是低密度脂蛋白氧化修飾生成的氧化性低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的主要因素[6]，是AS預(yù)防和治療的關(guān)鍵靶點。本研究通過復(fù)制ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷模型，探討齊墩果酸對HUVECs的保護(hù)作用，并進(jìn)一步對其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；723型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；IX50型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；TDL-50B型低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸（美國Sigma公司，批號：05504，純度：99%）；人膽囊收縮素（CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所，批號：C0038）；ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司，批號：YB-002-1）；維生素E（美國Sigma公司，批號：S20796-254）；過氧化氫酶（CAT）測試盒（批號：20140227）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測試盒（批號：20140220）、一氧化氮（NO）測試盒（批號：20140227）、總一氧化氮合酶（NOS）測試盒（批號：20140220）均購于南京建成生物工程研究院。

1.3 細(xì)胞

HUVECs（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將生長狀態(tài)良好的傳代HUVECs加入胰蛋白酶消化1 min，吹打下細(xì)胞懸液離心后棄上清液，再加入適量含有10%滅活胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

2.2 復(fù)制模型細(xì)胞ox-LDL最適質(zhì)量濃度的篩選

每孔分別加入終質(zhì)量濃度含0（即對照組）、25、50、100、200、400 μg/ml ox-LDL的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基孵育HUVECs 24 h后，每孔加入10μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度（OD）為細(xì)胞活性，按下式計算細(xì)胞存活率，重復(fù)3次。另設(shè)僅有培養(yǎng)液的為空白對照組。細(xì)胞存活率（%）＝（試驗組OD450－空白對照組OD450）/（對照組OD450－空白對照組OD450）×100%。

2.3 齊墩果酸最適濃度的篩選

精密稱取齊墩果酸0.022 8 g，溶于1 ml DMSO中制備50 mmol/L貯備液，－20 ℃貯藏，備用，試驗時用DMEM高糖培養(yǎng)基將貯備液稀釋；取HUVECs（細(xì)胞密度為1.5×108L－1），按每孔100 μl細(xì)胞加入96孔板，分別加入濃度為0、10、20、40、60、80、100μmol/L的齊墩果酸，每組6孔，培養(yǎng)24 h后，按“2.2”項下方法以CCK-8法檢測并計算細(xì)胞存活率。

2.4 齊墩果酸對模型細(xì)胞的保護(hù)作用

試驗隨機(jī)均分為7組，即正常對照（正常培養(yǎng)液）組、模型（正常培養(yǎng)液）組、維生素E（200μg/ml）組與齊墩果酸①、②、③、④（5、10、20、40 μmol/L）組。按“2.2”項下方法接種96孔板，加入相應(yīng)藥液，預(yù)培養(yǎng)16 h后，除正常對照組外其余組加入終質(zhì)量濃度為100 μg/ml ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用CCK-8法檢測并計算各組細(xì)胞存活率。收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加細(xì)胞裂解液，冰上裂解1 h，4 ℃下，以離心半徑為9 cm、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按試劑盒說明測定各組細(xì)胞內(nèi)總蛋白及CAT、GSH-PX、NOS活性與NO含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 復(fù)制模型細(xì)胞ox-LDL最適質(zhì)量濃度的篩選

與0μg/ml比較，其余質(zhì)量濃度下細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。IC50＝100 μg/ml，因此選取100 μg/ml ox-LDL作為復(fù)制HUVECs損傷模型的質(zhì)量濃度。復(fù)制模型細(xì)胞ox-LDL最適質(zhì)量濃度的篩選見表1。

表1 復(fù)制模型細(xì)胞ox-LDL最適質(zhì)量濃度的篩選（，n＝6）Tab 1 Screening of optimal concentration of ox-LDL on model cell（，n＝6）

表1 復(fù)制模型細(xì)胞ox-LDL最適質(zhì)量濃度的篩選（，n＝6）Tab 1 Screening of optimal concentration of ox-LDL on model cell（，n＝6）

與0μg/ml比較：＊P＜0.05vs.0μg/ml：＊P＜0.05

3.2 齊墩果酸最適濃度的篩選

與0 μmol/L比較，齊墩果酸濃度為60 μmol/L時細(xì)胞存活率降低，且隨著齊墩果酸濃度的增高，細(xì)胞存活率逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，選擇齊墩果酸濃度0～40 μmol/L范圍內(nèi)進(jìn)行以下試驗。齊墩果酸最適濃度的篩選見圖1。

圖1 齊墩果酸最適濃度的篩選（，n＝6）與0 μmol/L比較：＊P＜0.05；與60 μmol/L比較：#P＜0.05；與80 μmol/L比較：ΔP＜0.05Fig 1 Screening of optimal concentration of oleanolic acid（，n＝6）vs.0 μmol/L：＊P＜0.05；vs.60 μmol/L：#P＜0.05；vs.80 μmol/L：ΔP＜0.05

3.3 齊墩果酸對模型細(xì)胞存活率的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，齊墩果酸①、②、③、④組細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中齊墩果酸④組比齊墩果酸①組細(xì)胞存活率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證明40μmol/ml齊墩果酸有較強的抗氧化能力。齊墩果酸對模型細(xì)胞存活率的影響見表2。

3.4 齊墩果酸對模型細(xì)胞NO、NOS、CAT、GSH-PX水平的影響

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞CAT、GSH-PX、NOS活性減弱，NO含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，齊墩果酸①、②、③、④組CAT、GSH-PX、NOS活性增強，NO含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。齊墩果酸對模型細(xì)胞CAT、GSH-PX、NO、NOS水平的影響見表3。

4 討論

ox-LDL在AS的發(fā)展中起重要作用[7]。經(jīng)氧化修飾而成的ox-LDL水平，已成為臨床心腦血管病的一個重要生化標(biāo)志[7]。Fu R等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL作用內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中的F肌動蛋白（F-actin）被破壞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞對脂質(zhì)成分的通透性增加，刺激活性氧（ROS）過度生成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞氧化損傷，此時機(jī)體開啟抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)了GSH-PX、CAT等抗氧化酶合成[9]。這些抗氧化酶通過清除ROS，發(fā)揮抑制氧化損傷的作用[10-11]。本研究以ox-LDL刺激HUVECs復(fù)制AS模型，模型組HUVECs細(xì)胞存活率明顯降低，GSH-PX與CAT活性明顯下降，表明ox-LDL通過抑制GSH-PX與CAT活性，誘導(dǎo)氧化損傷。給予齊墩果酸預(yù)處理，能夠明顯提升HUVECs細(xì)胞活力，且GSH-PX與CAT的活力明顯增強。提示齊墩果酸通過提高抗氧化酶GSH-PX、CAT活性，減輕ox-LDL對HUVECs細(xì)胞的氧化損傷，能有效抑制AS進(jìn)展。齊墩果酸提高抗氧化酶活性的作用，可能與其富含不飽和基團(tuán)的三萜類物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]。

表2 齊墩果酸對模型細(xì)胞存活率的影響（，n＝6）Tab 2 Effects of OA on survival rate of damaged cell（，n＝6）

表2 齊墩果酸對模型細(xì)胞存活率的影響（，n＝6）Tab 2 Effects of OA on survival rate of damaged cell（，n＝6）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與齊墩果酸①組比較：ΔP＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05；vs.oleanolic acid ①group：ΔP＜0.05

表3 齊墩果酸對模型細(xì)胞CAT、GSH-PX、NO、NOS水平的影響（，n＝6）Tab 3 Effects of OA on the levels of CAT，GSH-PX，NO and NOS in damaged cell（，n＝6）

表3 齊墩果酸對模型細(xì)胞CAT、GSH-PX、NO、NOS水平的影響（，n＝6）Tab 3 Effects of OA on the levels of CAT，GSH-PX，NO and NOS in damaged cell（，n＝6）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞中由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化產(chǎn)生血管內(nèi)皮舒張因子NO[13]。NO通過調(diào)控四氫生物蝶呤（BH4），降低體內(nèi)ROS含量[14]，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于氧化侵襲的作用。本研究對細(xì)胞中NO含量以及NOS活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)ox-LDL損傷的HUVECs細(xì)胞中，NO含量減少，NOS活性降低，表明NO和NOS作為抗氧化因子，在HUVECs細(xì)胞氧化損傷中受到抑制。經(jīng)過齊墩果酸預(yù)處理，這兩項指標(biāo)均有不同程度的升高，證實齊墩果酸通過激活NOS，促進(jìn)NO生成，保護(hù)HUVECs細(xì)胞。最近，Gkaliagkousi E等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞NO合成酶基因表達(dá)，從而抑制NO合成。齊墩果酸提升NO和NOS的內(nèi)皮保護(hù)作用，是由于NO對ROS的直接清除作用，還是涉及到NOS的基因調(diào)控，仍需進(jìn)一步研究證實。

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