張勝男，呂建華，常建華，韓明浩，劉 昆，海 巖，劉 威，吳樹清

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

藍舌病(Bluetongue，BT)是由藍舌病病毒(BTV)以庫蠓作為傳播媒介引起的一種主要侵害家畜和野生反芻獸的傳染病。BTV 屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，具有多個血清型，已由原來的24 種血清型增加到26 種血清型即BTV25(瑞士，2008)[1]和BTV26(科威特，2011)[2]，而型與型之間不發(fā)生交叉免疫。不同血清型的BTV 引起不同程度的臨床癥狀。

一般認為可以傳播BTV 的庫蠓分布在北緯40°至南緯35°，但近年來隨著全球氣候變暖，BT 的分布范圍可擴展至北緯50°附近。1979 年我國云南首次報導(dǎo)綿羊BT[3]，隨后湖北(1983)、安徽(1985)、四川(1988)、山西(1991)也相繼暴發(fā)該病，內(nèi)蒙古、廣東、河北等10 個省也分別有BT 血清陽性個體檢出，在我國已經(jīng)檢出BTV-1，2，3，4，12，15，16 7 種血清型，其中1 型和16 型是主要的致病血清型[4]。近年來，許多歐洲國家BT 頻繁暴發(fā)，BT 分布范圍呈現(xiàn)不斷擴大的趨勢，如何控制和預(yù)防BT 已成為國際重大動物傳染病研究中的一個熱點。楊濤等首次建立了BTV 的反向遺傳操作系統(tǒng)，為BTV 的致病機理、傳播機制、基因組功能的深入研究以及研制疫苗做出了重要貢獻[5]。

1986 年內(nèi)蒙古自治區(qū)首次在山羊中檢測出BT抗體[6]。為了解該病在內(nèi)蒙古的流行分布情況，本研究分別在內(nèi)蒙古阿拉善盟、巴彥淖爾盟、興安盟、錫林郭勒盟等有疑似BT 病例地區(qū)采集血液樣品進行BT 流行病學調(diào)查研究，為該病的防控提供了實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標準BTV陽性對照及臨床樣品 標準BTV 陽性血清、血液樣品由云南省畜牧獸醫(yī)科學院提供；臨床樣品為2013 年采自內(nèi)蒙古自治區(qū)6 個盟市絨山羊、綿羊、牛的212 份抗凝血及對應(yīng)血清(表1)。

1.2 主要試劑 ELISA 檢測試劑盒由云南省畜牧獸醫(yī)科學院提供；QIAGEN RNeasy Mini Kit、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、100 bp DNA Marker 均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR 擴增試劑盒購自Promega 公司。

檢測引物序列由云南省畜牧獸醫(yī)科學院提供，對BTV RNA6 片段進行PCR 擴增，RT-PCR 檢測引物 為 BTV-S6-A：5'-GTTCTCTAGTTGGCAACCAC C-3' 和BTV-S6-B：5'-AAGCCAGACTGTTTCCCGA T-3'；套式PCR 檢測引物為BTV-S6-C：5'-GCAGCA TTTTGAGAGAGCGA-3' 和BTV-S6-D：5'-CCCGATC ATACATTGCTTCCT-3'。

1.3 競爭ELISA(C-ELISA)方法檢測 常規(guī)方法處理采集的212 份不同種類動物血液樣品，將標準陽性血清及制備的待檢血清分別做標記并按照ELISA檢測試劑盒說明書進行BTV 血清抗體檢測。

1.4 套式RT-PCR方法檢測

1.4.1 血液樣品處理 將標準陽性血液樣品及待檢樣品抗凝血置于對應(yīng)的Ep 管并做標記，離心，吸棄上清液。在血細胞沉淀中加入PBS，重懸細胞，離心，吸棄上清液。利用RNase-free ddH2O 低滲溶解細胞，所得細胞離解液用于提取RNA。

1.4.2 樣品總RNA 提取 根據(jù)QIAGEN RNeasy Mini Kit 說明書提取總RNA。

1.4.3 雙鏈RNA 變性 標記PCR 反應(yīng)管，在對應(yīng)管中加入制備的標準陽性及待檢血液樣品總RNA，置PCR 儀中95 ℃變性5 min，速取出置冰上。

1.4.4 RT-PCR 擴增反應(yīng) 反應(yīng)體系2×1 Step Buffer(Dye Plus)12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，引 物BTV-S6-A/BTV-S6-B(20 pmol/μL)各0.5 μL，模板5 μL，ddH2O 補至25 μL。擴增條件：45 ℃40 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72℃5 min。

1.4.5 套式PCR 擴增反應(yīng) 反應(yīng)體系Premix Ex Taq Ver.2(loading Dye Mix)12.5 μL，引物BTV-S6-C/BTV-S6-D(20 pmol/μL)各0.5 μL，RT-PCR 擴 增產(chǎn)物1 μL，ddH2O 補至25 μL。擴增條件：94 ℃1 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃20 s，40 個循環(huán)；72 ℃5 min。

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)含核酸染料的3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計分析 對內(nèi)蒙古地區(qū)血液樣品來源地的緯度、6 月～9 月平均溫度、動物品種及不同的飼養(yǎng)方式、不同方法的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 血液樣品檢測結(jié)果 根據(jù)212 份血液樣品的采集地點、地區(qū)緯度、6 月～9 月平均氣溫、飼養(yǎng)方式，分別采用C-ELISA 和套式RT-PCR 兩種檢測方法進行比較，結(jié)果見表1。

表1 血液樣品檢測結(jié)果Table 1 The statistics of the blood samples detections

2.2 C-ELISA 采用C-ELISA 對標準陽性血清及待檢血清進行檢測，數(shù)據(jù)符合實驗數(shù)據(jù)合格標準。本研究檢測血清樣品共212 份，利用酶標儀測定各血清樣品OD450nm值，并將其輸入由云南省畜牧獸醫(yī)科學院提供的EXCEL 表格進行自動計算抑制率。根據(jù)實驗結(jié)果判定標準判斷陽性、弱陽性、陰性血清樣品數(shù)量，統(tǒng)計結(jié)果見圖1。其中弱陽性樣品數(shù)量為13 份，對該13 份樣品進行了重復(fù)檢測，其結(jié)果仍為30 %

圖1 血清抑制率及其樣本數(shù)量分布Fig.1 The assay of serum samples

2.3 套式RT-PCR擴增 采用套式RT-PCR 對標準陽性血液樣品及臨床血液樣品進行檢測，結(jié)果顯示標準陽性血液樣品在RT-PCR 檢測及套式PCR 檢測中分別在274 bp、101 bp 出現(xiàn)目的片段。陰性對照均未出現(xiàn)目的片段。212 份血液樣品中陽性樣品61 份，總陽性率為28.77 %(61/212)。

2.4 不同動物種類感染BT的情況 按不同動物種類分組進行比較，212 份血液樣品的PCR 檢測結(jié)果顯示，綿羊血液樣品有80 份，陽性率為21.25 %(17/80)；絨山羊血液樣品有116 份，陽性率為35.35%(41/116)；牛血液樣品有16 份，陽性率為18.75 %(3/16)(圖2)。

圖2 不同的動物種類BT 感染情況Fig.2 The situation of the prevalence of BT infections of different breeds and animals

3 討論

庫蠓是BT 的主要傳播媒介，其活動范圍直接影響B(tài)T 的流行分布情況。吸血庫蠓在我國各地出現(xiàn)時間存在差異。在北方4 月～10 月均有發(fā)生[7]。根據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，內(nèi)蒙古地區(qū)吸血庫蠓種類多達36 種之多[8]。本研究中樣本采集時間在6 月～9 月，各地區(qū)氣溫在17.7 ℃～21.7 ℃，這些自然條件為庫蠓成蟲的生長和繁殖提供了適宜環(huán)境。1986 年內(nèi)蒙古巴彥淖爾盟在山羊中首次檢測出BT 抗體[6]，本研究也在臨床血液樣品中檢測出BT 陽性個體，表明該病已在內(nèi)蒙古地區(qū)由最初發(fā)生地區(qū)緯度40°13'N 發(fā)展至45°05'N，這可能與全球氣候的不斷變化、氣溫不斷地升高進而影響吸血庫蠓的活動范圍有關(guān)。

利用C-ELISA 方法檢測212 份不同動物種類血清樣品，其中陽性率為29.72 %(63/212)；弱陽性率為6.13 %(13/212)。利用套式RT-PCR 方法檢測的總陽性率為28.77 %(61/212)。本研究利用兩種方法在內(nèi)蒙古多地區(qū)均檢測出BT 陽性個體，但具體是哪種血清型的BTV 尚未清楚，有待科研人員做進一步研究。

根據(jù)套式RT-PCR 檢測方法所得結(jié)果統(tǒng)計，212份不同動物種類血液樣品中綿羊感染率為21.25 %(17/80)、絨山羊感染率為35.35 %(41/116)、牛感染率為18.75 %(3/16)，表明綿羊、絨山羊、牛均可以不同程度的感染BTV，但均未表現(xiàn)出臨床癥狀。為本研究提供血液樣品的動物的飼養(yǎng)方式分為圈養(yǎng)和散養(yǎng)。集寧市的6 頭牛為圈養(yǎng)，其余均為散養(yǎng)。圈養(yǎng)的感染率為16.67%(1/6)，散養(yǎng)的感染率為29.13%(60/206)。散養(yǎng)家畜BTV 感染率高于圈養(yǎng)。

以上結(jié)果表明內(nèi)蒙地區(qū)BT 流行范圍比較廣泛，因此了解內(nèi)蒙古地區(qū)BT 的流行情況以及掌握BTV檢測方法，對預(yù)防控制BT 具有重要意義。為預(yù)防控制BT 的傳播有以下防護措施作為參考：(1)內(nèi)蒙古各地區(qū)應(yīng)加強對BT 的監(jiān)控，定期進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性個體應(yīng)按《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定，及時采取封鎖、隔離、撲殺、銷毀、消毒、無害化處理、緊急免疫接種等強制性措施；(2)把握好家畜交易檢疫環(huán)節(jié)，禁止血液陽性個體進入家畜交易；(3)BT 是蟲媒傳染病，所以在春、夏、秋季節(jié)做好消滅傳播媒介庫蠓工作，提高畜舍衛(wèi)生條件。

[1]Hofmann M A,Renzullo S,Mader M,et al.Genetic characterization of toggenburg orbivirus,a new bluetongue virus,from goats,Switzerlan[J].Emerg Infect Dis,2008,14(12):1855-1861.

[2]Maan S,Maan N S,Nomikou K,et al.Novel bluetongue virus sertype from Kuwait[J].Emerg Infect Dis,2011,17(5):886-889.

[3]張念祖，張開禮，李志華，等.綿羊藍舌病調(diào)查研究[J].云南畜牧獸醫(yī)，1989，4：3-13.

[4]魏鵬.藍舌病病毒1 型VP2、VP5 蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D].哈爾濱：中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，2013.

[5]楊濤，徐青元，孫恩成，等.藍舌病病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2014，36(2)：85-89.

[6]林理惠，李志華，等.四川省藍舌病調(diào)查和病原分離報告[J].云南畜牧獸醫(yī)，1989，4：57-60.

[7]李鐵生.中國經(jīng)濟昆蟲志，第13 冊，雙翅目，蠓科[M].北京：科學出版社，1978.

[8]能乃扎布.內(nèi)蒙古昆蟲[M].呼和浩特：人民出版社，1999.