馮旭飛，王遠(yuǎn)微，李定霏，楊發(fā)龍*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都市水生動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)站，四川 成都 610071)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)可引起山羊、綿羊和一些野生反芻動(dòng)物的非典型性肺炎[1]。該病原在全球范圍內(nèi)廣泛流行，其中對(duì)四川省山羊呼吸道病原進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，MO 是引起四川省山羊支原體性肺炎的主要病原[2]，因此對(duì)該病原的準(zhǔn)確檢測(cè)十分重要。溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica，Mh)是存在于牛、羊等反芻動(dòng)物以及其他多種動(dòng)物上呼吸道的常在菌和機(jī)會(huì)致病菌[3]。在某些誘發(fā)因素作用下，特別是MO 感染存在的情況下，極易引起Mh 快速增殖而導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生致死性肺炎[1,4]，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。所以建立一種可以同時(shí)快速特異性檢測(cè)MO 和Mh 的方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，國內(nèi)外針對(duì)MO 和Mh，均分別建立了特異的PCR 方法，并在這兩種病原的檢測(cè)、鑒定及流行病學(xué)調(diào)查等方面得到了廣泛的應(yīng)用[1,5-6]，但尚無可以同時(shí)檢測(cè)這兩種病原的PCR 方法的報(bào)道。本研究通過兩對(duì)特異性引物，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)MO 和Mh 的雙重PCR 方法，為快速特異性檢測(cè)這兩種病原及其感染的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種新方法。

1 材料和方法

1.1 菌株及臨床樣本 Mh(ATCC?31611TM)、結(jié)膜支原體(M.conjunctivae)(ATCC?25834TM)均購自美國ATCC 公司；MO SC01 株、金黃色葡萄球菌(S.aureus)SW07 株、大腸桿菌(E.coli)013 株、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、羊源鏈球菌(Streptococcus)SWUN3052 株、多殺性巴氏桿菌(P.multocida)CD-2 株均為西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；絲狀支原體山羊亞種(M.mycoides subsp.capri)Y-goat 株和PG3 株、無乳支原體(M.agalactiae)PG2 株、山羊支原體山羊肺炎亞種(M.capricolum subsp.Capripneumoniae)C87-1株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛支原體(M.bovis)為重慶疾控中心惠贈(zèng)；臨床樣本共160 份，于2013年～2014 年采集自四川省不同地區(qū)有不同程度呼吸道癥狀的2～3 歲山羊或綿羊，其中肺組織樣本45份(簡陽市山羊15 份，甘孜州、阿壩州綿羊各15份)，鼻腔棉拭子115 份(簡陽市山羊30 份，樂至縣山羊20 份，青白江區(qū)山羊25 份，大邑縣綿羊20份，甘孜州綿羊20 份)。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 Taq DNA 聚合酶及DNA Marker Ⅰ均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T 購自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit(100)、Plasmid Mini Kit Ⅰ(100)均購自O(shè)MEGA 公司；E.coli 感受態(tài)細(xì)胞JM109 購自北京索萊寶科技有限公司；TSA 和TSB 液體培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；支原體的復(fù)蘇和培養(yǎng)采用改良Hayfliek's 液體培養(yǎng)基[7]。

1.3 引物設(shè)計(jì) 采用軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)MO 特異性引物HSP70F/HSP70R。該引物是本實(shí)驗(yàn)室對(duì)14 株MO 的熱休克蛋白70(hsp70)基因進(jìn)行克隆、測(cè)序、進(jìn)行進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上選取保守序列所設(shè)計(jì)；Mh則直接采用由Shanthalingam 等[5]所設(shè)計(jì)的特異性引物Mh F/Mh R，該引物的靶基因?yàn)間cp(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primers used for the duplex PCR

1.4 DNA的提取 按常規(guī)方法培養(yǎng)相關(guān)的菌株，收集臨床樣品拭子浸出液及采用研磨處理臨床肺臟樣品組織，取其離心后的上清液，利用常規(guī)的酚/氯仿萃取法提取其總DNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.5 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化 將MO 和Mh 的引物分別按照終濃度0.2 μmol/L：0.2 μmol/L 為基礎(chǔ)，以不同的比例混合進(jìn)行引物比例的優(yōu)化。采用優(yōu)化的引物比進(jìn)行PCR 退火溫度的優(yōu)化。溫度梯度設(shè)置為54 ℃～62 ℃。

1.6 特異性試驗(yàn) 采用優(yōu)化的PCR 反應(yīng)條件，對(duì)金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、Mh、大腸桿菌、鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、絲狀支原體山羊亞種Y-goat 株及PG3 株、牛支原體、無乳支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、結(jié)膜支原體及MO SC01 株的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 提取MO 分離株SC01 的基因組DNA，并采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度后進(jìn)行8個(gè)10 倍的系列稀釋，然后根據(jù)SC01 的全基因組長度計(jì)算DNA 的檢出量[8]。

挑取Mh 單菌落接種于TSB 培養(yǎng)基中37 ℃160 r/min 水平搖床培養(yǎng)12 h，用無菌TSB 培養(yǎng)基將Mh 菌液進(jìn)行10 個(gè)10 倍系列稀釋后取200 μL 涂布于TSA 培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行，37 ℃過夜培養(yǎng)后計(jì)算平板的菌落數(shù)以推算原始菌液的濃度。同時(shí)將原始菌液提取基因組DNA 后進(jìn)行8 個(gè)10 倍的系列稀釋。

將同一稀釋度的兩種病原按1∶1 的體積進(jìn)行混合作為模板，以上述已優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙重PCR 檢測(cè)。同時(shí)，采用上述MO 及Mh 特異性引物，分別對(duì)不同稀釋度的模板進(jìn)行檢測(cè)，以比較雙重PCR 和單一PCR 的敏感性。

1.8 臨床樣本的檢測(cè) 對(duì)臨床采集的115 份鼻腔棉拭子和45 份肺組織樣品提取全基因組DNA，采用單一PCR 和上述方法對(duì)MO 和Mh DNA 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算這兩種病原的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果 分別以MO 和Mh DNA以及按1∶1 混合的兩種病原的DNA 為模板，進(jìn)行雙重PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示以單一病原DNA 為模板時(shí)，分別得到135 bp 或227 bp 的單一擴(kuò)增片段；將兩種病原DNA 混合后作為模板，能夠擴(kuò)增得到預(yù)期大小的兩個(gè)片段，而無模板對(duì)照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。

圖1 雙重PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplicons of the duplex PCR

2.2 雙重PCR條件優(yōu)化結(jié)果 對(duì)PCR 擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化后，得到最終PCR 反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL(并按不同比例進(jìn)行調(diào)整)、5 U/μL Taq 酶0.4 μL、DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)MO 質(zhì)粒DNA 和Mh 的基因組DNA 進(jìn)行10 倍系列稀釋后，以各稀釋度的兩種DNA 分別混合并作為模板進(jìn)行雙重PCR 和單一PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，雙重PCR 對(duì)MO的最低檢測(cè)限為2.06×103拷貝/μL，對(duì)Mh 的最低檢測(cè)限為6.37 cfu/mL，與單獨(dú)PCR 相同(圖2)。

圖2 雙重PCR 的敏感性Fig.2 Sensitivity of the duplex PCR

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 采用所建立的雙重PCR 方法，對(duì)MO、Mh 及其他多種病原菌的DNA 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法能夠檢測(cè)MO 和Mh，而其它病原均未檢出(圖3)。經(jīng)3 次重復(fù)檢測(cè)，此結(jié)果穩(wěn)定。

圖3 雙重PCR 特異性檢測(cè)Fig.3 Specificity of the duplex PCR

2.5 臨床樣本的檢測(cè) 對(duì)臨床采集的115 份鼻腔棉拭子和45 份肺組織提取DNA，分別用單一PCR 進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用建立的雙重PCR 方法對(duì)MO 和Mh DNA 進(jìn)行檢測(cè)(表2)。單一PCR 檢出為陽性的樣本，雙重PCR 也全部檢出。

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of detection clinical samples

3 討論

本研究采用兩對(duì)特異性的引物所建立的雙重PCR 方法僅對(duì)MO 和Mh 有陽性擴(kuò)增，而對(duì)其他引起羊呼吸道疾病的病原，特別是對(duì)其他支原體的擴(kuò)增均為陰性，表明其特異性較好。這有助于對(duì)臨床病例進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，從而對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中快速采取相應(yīng)防治措施具有非常重要的意義。結(jié)果同時(shí)表明該方法具有較高的敏感性，對(duì)MO 和Mh 的最低檢測(cè)限分別為2.06×103拷貝/μL 和6.37 cfu/mL。高敏感性有助于對(duì)感染初期的動(dòng)物進(jìn)行診斷，也可實(shí)現(xiàn)對(duì)含有較低病原體的樣本進(jìn)行成功檢測(cè)，從而可以避免對(duì)感染動(dòng)物的漏檢，對(duì)于準(zhǔn)確診斷及全面的流行病學(xué)調(diào)查均有重要意義。

采用本方法和單一PCR 分別對(duì)臨床采集的160份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明單一PCR 和本方法對(duì)MO 和Mh 的檢出結(jié)果符合率為100 %，表明該方法對(duì)臨床樣本檢測(cè)的結(jié)果可信度高，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法靈敏度較高，表明兩對(duì)引物的混合并不影響其靈敏度；采用上述檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本的檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)有57 份鼻拭子和24 份肺組織樣品同時(shí)檢測(cè)出MO 和Mh。首先，該結(jié)果表明所建立的方法可以應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)，不僅可以檢測(cè)只含有MO 或Mh 單獨(dú)感染的樣本，同時(shí)可以檢測(cè)同時(shí)感染有這兩種病原的臨床樣本。結(jié)果還表明，MO 和Mh 很可能是引起羊發(fā)生呼吸道疾病的重要病原，而且存在普遍的混合感染現(xiàn)象，這與Thomas等人的報(bào)道相一致[9]。

總之，本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)MO 和Mh的雙重PCR 方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，比目前所使用的單獨(dú)檢測(cè)MO 或Mh 的PCR 方法相比更加方便、省時(shí)、省力。

[1]Dassanayake R P,Shanthalingam S,Herndon C N,et al.Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatal Mannheimia haemolytica pneumonia[J].Vet Microbiol,2010,145(3-4):354-359.

[2]王華，楊發(fā)龍，王永，等.山羊支原體性肺炎流行病學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(1)：210-214.

[3]Goncalves R,Mariano I,A,et al.Atypical non-progres-sive pneumonia in goats[J].Vet J,2010,183(2):219-221.

[4]Zecchinon L,Fett T,Desmecht D.How Mannheimia haemolytica defeats host defence through a kiss of death mechanism[J].Vet Res,2005,36(2):133-148.

[5]Shanthalingam S,Goldy A,Bavananthasivam J,et al.PCR assay detects Mannheimia haemolytica in culture-negative pneumonic lung tissues of bighorn sheep(Oviscanadensis)from outbreaks in the western USA,2009-2010[J].J Wildl Dis,2014,50(1):1-10.

[6]冷青文，李志遠(yuǎn)，魯海富，等.盤羊體內(nèi)綿羊肺炎支原體的分離和鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，3(36)：197-200.

[7]Thiaucourt F,Bolske G.Contagious caprine pleuropneumonia and other pulmonary mycoplasmoses of sheep and goats[J].Rev Sci Tech,1996,15(4):1397-1414.

[8]Yang Fa-long,Tang Cheng,Wang Yong,et al.Genome Sequence of Mycoplasma ovipneumoniae Strain SC01[J].J Bacteriol,2011,193(18):5018.

[9]Besser T E,Highland M A,Baker K,et al.Causes of pneumonia epizootics among bighorn sheep,Western United States,2008-2010[J].Emerg Infect Dis,2012,18(3):406-414.