許 明，龔建森，林 勇，韓先干，朱春紅，周守長(zhǎng)，俞 燕，莊林林，張 笛，竇新紅，徐 步*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，江蘇 南京 210014；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

沙門菌(Salmonella)不僅能引起畜禽及其它動(dòng)物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，而且還能通過污染食品導(dǎo)致人食物中毒，占細(xì)菌性食物中毒的42.6 %～60 %[1]。研究表明，沙門菌感染的禽群是通過食物鏈傳給人的沙門菌最為常見的儲(chǔ)存庫(kù)之一，其原因是由于沙門菌在被感染的家禽中能通過水平傳播和垂直傳播引起廣泛流行，而這與家禽飼養(yǎng)數(shù)量巨大關(guān)系密切[2]。研究顯示，沙門氏菌眾多毒力基因的存在是其致病的主要原因，而不同毒力基因組合可能賦予其不同的致病力[3]。沙門菌毒力相關(guān)基因分布在毒力島、鞭毛、菌毛、噬菌體和質(zhì)粒等。通過對(duì)沙門菌毒力基因的研究，為進(jìn)一步研究細(xì)菌的致病性提供參考。生物被膜(Bacterial biofilms，BF)是單細(xì)胞生物體粘附在固體表面而聚集形成的一個(gè)群落，通過分泌多糖蛋白、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)將自身包裹其中。BF 已經(jīng)被證明在許多細(xì)菌中存在，包括沙門菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、嗜血桿菌和鴨疫里默氏桿菌等[4]。此外，BF 與細(xì)菌的耐藥性相關(guān)，當(dāng)細(xì)菌存在于BF 內(nèi)對(duì)抗菌藥物的抵抗能力顯著增強(qiáng)[5]。本研究通過對(duì)江蘇部分地區(qū)鴨源沙門菌的分離、血清學(xué)分型、毒力基因的檢測(cè)、耐藥性和BF 的研究，為鴨源沙門菌的致病機(jī)理研究及防控措施的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離株 鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)ATCC14028、布雷得尼沙門菌(S.bredeney)CMCC50015、禽多殺性巴氏桿菌(P.multocida)CVCC44801 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所保存提供；33 株鴨源沙門菌分離株為本實(shí)驗(yàn)室2012 年以來分離自江蘇地區(qū)部分鴨場(chǎng)的發(fā)病或死亡鴨。

1.2 主要試劑 三糖鐵瓊脂、LB 瓊脂、SC 肉湯、DHL 瓊脂、MH 瓊脂、沙門菌成套生化鑒定管均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；沙門菌診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA Marker、Taq DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.3 鴨源沙門菌的鑒定與血清學(xué)分型 菌株的鑒定參考文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行，挑取疑似菌株接種于LB瓊脂，37 ℃過夜培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[7]的沙門菌鑒定引物，提取分離菌株的基因組DNA，采用沙門菌通用鑒定引物(5'-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3'/5'-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3')，擴(kuò)增其stn 基因片段，預(yù)期片段大小260 bp。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，共25 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。對(duì)PCR 鑒定陽性的菌株，用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)鑒定，并做葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)和動(dòng)力試驗(yàn)等進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。同時(shí)采用玻板凝集試驗(yàn)，通過沙門菌屬診斷血清進(jìn)行分離株的血清型鑒定。

1.4 鴨源沙門菌毒力相關(guān)基因的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[8]合成沙門菌17 種毒力基因的多重PCR 引物(引物序列信息如讀者需要作者可以提供)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s、66 ℃30 s、72 ℃2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。以鼠傷寒沙門菌ATCC14028 和布雷得尼沙門菌CMCC50015為陽性對(duì)照，禽多殺性巴氏桿菌CVCC44801 為陰性對(duì)照。

1.5 鴨源沙門菌藥物敏感性檢測(cè) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)制定的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)15 種抗菌藥的抗藥性進(jìn)行檢測(cè)。即被檢細(xì)菌培養(yǎng)于MH 瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻貼于固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)過夜后，測(cè)量藥敏片的抑菌圈直徑。參照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)，判定被檢細(xì)菌對(duì)每種藥物的敏感性，分別標(biāo)記為敏感(Susceptible，S)、中介(Moderate，M)或耐藥(Resistance，R)菌株。

1.6 鴨源沙門菌BF檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[9]的方法，在無菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入OD600nm為0.1 的菌液100 μL，陰性對(duì)照孔加入等量的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36 h；棄去培養(yǎng)液并用滅菌PBS 洗滌3次，自然風(fēng)干；結(jié)晶紫染色30 min，PBS 洗滌；95%乙醇溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm。分離株的BF 形成能力被分為4 個(gè)等級(jí)[10]，OD 為被檢細(xì)菌的OD595nm，ODc 為陰性對(duì)照的OD595nm，具體判定標(biāo)準(zhǔn)：OD

2 結(jié)果

2.1 鴨源沙門菌的鑒定與血清學(xué)分型 對(duì)疑似沙門菌分離株結(jié)合選擇性培養(yǎng)基的鑒別結(jié)果，進(jìn)行三糖鐵試驗(yàn)與生化鑒定(靛基質(zhì)、賴氨酸脫羧、尿素酶、氰化鉀、山梨醇、甘露醇、水楊苷、丙二酸鹽、衛(wèi)矛醇、ONPG)，并采用沙門菌通用鑒定引物PCR 擴(kuò)增stn 基因和沙門菌毒力基因的多重PCR 鑒定(圖1)。結(jié)果顯示，33 株分離菌均符合沙門菌特征。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，33 株沙門菌分離株分屬于B、C2 和D1 3 個(gè)血清群的4 種不同血清型，其中48.5%的分離株為查理沙門菌(16 株)，39.4 %的分離株為印第安納沙門菌(13 株)，9.1 %的分離株為腸炎沙門菌(3 株)，3.0%的分離株為鼠傷寒沙門菌(1 株)(圖2)。

圖1 沙門菌stn 基因及毒力基因的單一和多重PCR 鑒定Fig.1 Identification of Salmonella stn gene and virulence genes by single and multiple PCR

2.2 鴨源沙門菌的毒力相關(guān)基因的檢測(cè) 鴨源沙門菌17 個(gè)毒力相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果表明，33 株分離株可以分為6 種毒力基因型，其中查理沙門菌含有3 種，印第安納沙門菌含有2 種，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌均為同一種基因型(僅缺失cdtB 基因)。在33 株分離株中保守存在的基因有9 種，分別為pagC、msgA、sipB、prgH、spaN、tolC、iroN、sopB及pefA；檢測(cè)陽性率超過80 %的基因有4 個(gè)，分別為invA、orgA、sitC 及spiA 基因，檢出率分別為97.0 %、90.9 %、90.9 %及84.8 %；lpfC、cdtB、spvB 及sifA 基因的檢出率分別為60.6 %、39.4 %、12.1 %及12.1 %(表1)。

圖2 33 株鴨源沙門菌分離株的血清型分布Fig.2 Serotype distributions of 33 Salmonella isolates from ducks

表1 17 種毒力基因在33 株鴨源沙門菌分離株中的分布情況Table 1 Distribution of 17 virulent genes in 33 Salmonella isolates from ducks

2.3 鴨源沙門菌的藥物敏感性檢測(cè) 對(duì)33 株鴨源沙門菌進(jìn)行了15 種常見抗菌藥物的敏感性檢測(cè)。結(jié)果表明，耐藥性達(dá)到50 %以上的有9 種藥物，分別為氨芐西林、阿莫西林、鏈霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、甲氧氨嘧啶、復(fù)方新諾明、氯霉素和四環(huán)素，其中氨芐西林和甲氧氨嘧啶耐藥率最高，分別為100 %和96.7 %。頭孢類藥物耐藥率較低，分別為頭孢他啶(21.2 %)、頭孢噻肟(9.1 %)和頭孢曲松(0)。在33 株分離菌中，同時(shí)耐藥8 種以上的有14株(42.4 %)，耐藥最多的菌株可同時(shí)耐受14 種藥物，僅對(duì)一種藥物敏感。有3 株細(xì)菌只耐其中的2～3 種藥物，未發(fā)現(xiàn)不耐藥的菌株(表2)。

2.4 鴨源沙門菌的BF檢測(cè) BF 檢測(cè)結(jié)果表明，具有強(qiáng)BF 形成能力的分離株有3 株，中等的有11株，弱的有6 株，不形成BF 有13 株(圖4)。其中具有中等或強(qiáng)BF 形成能力的14 株細(xì)菌中，耐藥達(dá)到8 種以上有8 株(57.1 %)，在3 株BF 形成能力強(qiáng)的細(xì)菌中，有2 株耐藥達(dá)到12 種以上。在這14 株中等或強(qiáng)BF 形成能力細(xì)菌中，有6 株均對(duì)氨芐西林、阿莫西林、氯霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、甲氧氨嘧啶、復(fù)方新諾明、氯霉素和四環(huán)素具有耐藥性。

表2 33 株鴨源沙門菌分離株的藥敏試驗(yàn)Table 2 Drug sensitivity assay for 33 Salmonella isolates from ducks

圖3 33 株鴨源沙門菌分離株的BF 表型分析Fig.3 BF of 33 Salmonella isolates from ducks

3 討論

本研究對(duì)2013 年以來，江蘇部分地區(qū)臨床分離的33 株鴨源沙門菌進(jìn)行了血清學(xué)分型，結(jié)果表明其優(yōu)勢(shì)血清型為C2 群的查理沙門菌，其次為B 群的印第安納沙門菌，而常見的幾種鴨源沙門菌(如腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌)在本研究中并不占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。沙門菌的流行血清型與宿主來源、分離時(shí)間和分離地點(diǎn)均存在一定相關(guān)性，因此需加強(qiáng)對(duì)臨床流行菌株的監(jiān)測(cè)[11]。本研究從病鴨中首次分離到查理沙門菌，該血清型是引起人類腹瀉的重要血清型[12-13]，其公共衛(wèi)生學(xué)意義值得關(guān)注。

對(duì)33 株鴨源沙門菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明，pagC、msgA、sipB、prgH、spaN、tolC、iroN、sopB和pefA 為保守基因，其中prgH、tolC、sopB 和pefA與宿主識(shí)別和侵入有關(guān)，spaN 和sipB 與非吞噬細(xì)胞內(nèi)化或殺傷巨噬細(xì)胞有關(guān)，iroN 為鐵攝取基因，pagC 和msgA 與巨噬細(xì)胞內(nèi)生存有關(guān)。該檢測(cè)結(jié)果與國(guó)外報(bào)道基本一致[8]，但在pefA 基因的檢出率存在較大差異，是否與本研究中的菌株均來自同一宿主有關(guān)，需進(jìn)一步研究。根據(jù)對(duì)不同血清型菌株的比較顯示，查理沙門菌和印第安納沙門菌分別具有3 種和2 種基因型，而鼠傷寒和腸炎沙門菌僅有1種基因型，結(jié)果表明分離株來源越多，其基因型也越復(fù)雜[6]。而部分基因的分布也與血清型存在相關(guān)性，如spvB 和sifA 基因僅存在于鼠傷寒和腸炎沙門菌中，cdtB 基因僅存在于印第安納沙門菌中，而lpfC 存在于印第安納以外的幾種血清型中。Ewers等研究顯示血清型與毒力基因類型的關(guān)系可能與基因的水平轉(zhuǎn)移相關(guān)，其相關(guān)性及具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究[14]。

本研究對(duì)33 株鴨源沙門菌進(jìn)行了15 種藥物的藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果表明耐藥性達(dá)到50 %以上的藥物有9 種，耐藥最多的菌株可同時(shí)耐受14 種藥物，僅對(duì)一種藥物敏感，表明目前臨床沙門菌多重耐藥性非常嚴(yán)重，而這與抗菌藥的長(zhǎng)期不合理使用有密切關(guān)系，應(yīng)引起獸醫(yī)工作者的高度重視[15]。而頭孢類抗生素在本次研究中耐藥性較低(小于21.2 %)，臨床可以考慮作為治療鴨沙門菌感染的侯選藥物。

BF 是細(xì)菌防御抗菌藥物的天然屏障，是造成細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要因素之一。本研究通過結(jié)晶紫染色法對(duì)33 株細(xì)菌進(jìn)行BF 的檢測(cè)，結(jié)果表明，BF形成能力強(qiáng)的3 株分離株有2 株耐12 種以上的藥物。14 株BF 形成能力中等以上的菌株中，耐藥達(dá)到8 種以上的菌株占57.1%。本研究結(jié)果表明，鴨源沙門菌BF 的形成能力對(duì)細(xì)菌耐藥性具有重要意義。

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