袁 晉，孫 元，王春花，秦華洋，叢 鑫，李 素，羅玉子，劉 磊*，仇華吉*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種急性、熱性和高度致死性傳染病[1]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。CSFV 為單股正鏈RNA 病毒，黃病毒科瘟病毒屬成員[2]。

豬瘟兔化弱毒疫苗(即C 株)仍是目前對豬瘟流行和暴發(fā)進行防控最主要的疫苗。該疫苗安全，并且能夠誘導(dǎo)高水平的中和抗體；接種豬后，3 d 產(chǎn)生一定免疫力，1 周即可產(chǎn)生完全免疫保護，可在發(fā)生豬瘟疫區(qū)對未發(fā)病的豬進行緊急預(yù)防接種，以控制豬瘟的流行和暴發(fā)[3]。但其仍存在一些不足，例如：沒有一種有效的血清學(xué)檢測方法來區(qū)分疫苗免疫豬與豬瘟野毒感染豬(Differentiating infected from vaccinated animals，DIVA)[4]。因此，研制具有DIVA 特性的安全及高效的重組豬瘟疫苗具有重要的意義和廣泛的應(yīng)用價值。此前，本實驗室構(gòu)建了腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗rAdVSFV-E2[5-6]。該疫苗免疫后不受母源抗體的干擾，能夠?qū)SFV 強毒株的攻擊提供完全保護，免疫效果與C 株相同，并具有DIVA 特性[7]。本研究對該疫苗提供完全免疫保護的最早時間進行確定。

1 材料和方法

1.1 細胞、疫苗、病毒株及實驗動物 PK-15 細胞，CSFV 強毒石門株由本實驗室保存；表達CSFV石門株E2 基因的rAdV-SFV-E2 由本實驗室構(gòu)建[5]；豬瘟抗原和抗體均為陰性的實驗豬購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 針對CSFV E2 蛋白的單克隆抗體HQ06 由本實驗室制備；FITC 標記的鼠抗豬IgG 購自Sigma 公司；CSFV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒購自IDEXX 公司；病毒RNA 提取試劑盒購自QIAgen公司。

1.3 實驗設(shè)計 25 頭5 周齡健康仔豬隨機分成5組(A、B、C、D 和E 組)，每組5 頭。分組情況詳見表1。試驗期間，每天對全部豬進行體溫測定和臨床反應(yīng)觀察。攻毒后15 d 對全部豬進行迫殺。

1.4 阻斷ELISA試驗和中和試驗 免疫前、后每周及攻毒后每隔3 d(攻毒后0～15 d)，通過前腔靜脈對所有豬采血并分離血清，利用CSFV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測CSFV 特異性抗體的產(chǎn)生情況，具體操作方法按說明書進行。并按照歐盟豬瘟診斷標準中和試驗方法測定上述血清的中和抗體滴度。

表1 實驗設(shè)計Table 1 Experimental design

1.5 熒光定量RT-PCR 攻毒后每隔3 d(攻毒后0～15 d)采集抗凝血，用病毒RNA 提取試劑盒提取病毒總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，使用已報道熒光定量RT-PCR 方法[8]，檢測實驗豬血液中的CSFV RNA 拷貝數(shù)，評價病毒血癥。

1.6 病理學(xué)及組織病理學(xué)檢查 攻毒后15 d，將所有存活豬進行安樂死，觀察剖檢豬組織器官的病理變化情況，并采集剖檢豬的心、肝、脾、肺、腎、膀胱、頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和扁桃體等臟器按常規(guī)方法制備病理組織切片，進行病理組織學(xué)檢測。

2 結(jié)果

2.1 rAdV-SFV-E2免疫豬抗體產(chǎn)生情況 檢測結(jié)果顯示，rAdV-SFV-E2 免疫豬后，最早于免疫后3周可以在個別豬體內(nèi)檢測到低水平的CSFV 特異性抗體。攻毒后不同免疫組的抗體滴度變化差異較大，免疫后4 周攻毒組抗體滴度迅速上升，于攻毒后6 d 趨于穩(wěn)定，最終平均抗體阻斷率為85.23 %。免疫后3 周攻毒組于攻毒后3 d～6 d 抗體滴度急速上升，之后漸趨穩(wěn)定，最終平均抗體阻斷率為87.69 %。免疫后2 周攻毒組于攻毒后6 d 抗體才轉(zhuǎn)為陽性，至攻毒后9 d 抗體也漸趨穩(wěn)定，平均抗體阻斷率為83.38 %。免疫后1 周攻毒組于攻毒后6 d和9 d 各死亡1 只，剩余3 頭豬存活并于攻毒后9 d檢測到陽性CSFV 抗體，平均抗體阻斷率為69.49%，隨后抗體略有輕微上升，但變化不大(圖1)。

圖1 rAdV-SFV-E2 免疫豬后產(chǎn)生的CSFV 特異性抗體Fig.1 The anti-CSFV antibody levels in sera of the immunized pigs detected by blocking ELISA

當實驗豬中和抗體的滴度大于30 時，能夠?qū)SFV 強毒致死性攻擊提供完全保護[9]。中和抗體的檢測結(jié)果顯示，攻毒后，免疫后4 周攻毒組豬瘟中和抗體出現(xiàn)較早，于攻毒當天免疫后4 周即能檢測到陽性抗體；免疫后3 周和2 周攻毒組，于攻毒后6 d 檢測到豬瘟中和抗體轉(zhuǎn)陽；免疫后1 周攻毒組，攻毒后6 d 出現(xiàn)死亡，存活豬于攻毒后9 d 檢測到陽性豬瘟中和抗體。至試驗結(jié)束時，免疫后4 周和3 周攻毒組中和抗體滴度達到2048，甚至更高；免疫2 周后攻毒組稍低，平均中和抗體滴度達到1706；免疫1 周后攻毒組與前3 組相比相差較大，中和抗體滴度僅為208(表2)。

表2 免疫豬血清中和抗體滴度Table 2 Neutralizing antibody titers in the immunized pigs

2.2 免疫與攻毒后臨床表現(xiàn) 免疫后所有接種豬表現(xiàn)均正常，未出現(xiàn)體溫升高和食欲下降等異?，F(xiàn)象。攻毒后，免疫后4 周和3 周攻毒組，攻毒后體溫均保持在正常生理范圍之內(nèi)，一直持續(xù)到試驗結(jié)束，期間未出現(xiàn)豬瘟臨床癥狀。免疫后2 周攻毒組，于攻毒后2 d 出現(xiàn)了體溫升高，但表現(xiàn)不一致，其中有2 頭豬體溫升高了1 d，另外3 頭豬持續(xù)發(fā)熱4 d～5 d，隨后所有豬均恢復(fù)到正常體溫，發(fā)熱期間有個別豬出現(xiàn)了食欲減退、精神沉郁等典型的豬瘟臨床癥狀，隨后豬瘟典型癥狀逐漸消失，最終該組所有豬均存活。免疫后1 周攻毒組，也于攻毒后2 d 出現(xiàn)了體溫升高，隨后有2 頭豬死亡，其余3 頭豬均出現(xiàn)發(fā)熱，并且出現(xiàn)典型的豬瘟臨床癥狀，但均存活(表3)。

表3 所有免疫豬攻毒后的發(fā)熱及存活狀況統(tǒng)計Table 3 Fever and survival of the immunized pigs following virulent challenge

2.3 病毒血癥檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，免疫后4 周和3 周攻毒組所有豬于攻毒前后所有時間點均檢測到病毒血癥的存在。免疫后2 周攻毒組，僅于攻毒后6 d 檢測到低水平病毒RNA 的存在(約102拷貝/μL)。免疫后1 周攻毒組，于攻毒后3 d、6 d、9 d 和12 d均檢測到病毒RNA 的存在，其中攻毒后3 d 和6 d的含量較高，達到105拷貝/μL，攻毒后15 d 血液中未檢測到病毒RNA 的存在。陰性對照組從攻毒后3 d 就檢測到高水平的病毒RNA 的存在，最高達到108拷貝/μL(表4)。

2.4 病理學(xué)及組織病理學(xué)分析 攻毒后15 d，對病死豬和處死豬進行剖檢和組織病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示，免疫后4 周和3 周攻毒組所有豬，剖檢后各組織器官均正常，沒有發(fā)現(xiàn)典型性豬瘟病變。免疫后2 周攻毒組個別豬及免疫1 周攻毒組存活豬出現(xiàn)輕微的病理學(xué)及組織病理學(xué)變化，如淋巴結(jié)和扁桃體輕微出血、腫大、腎臟有少量針尖大小出血點；頜下淋巴結(jié)淋巴細胞輕度增生，腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)有少量嗜酸性粒細胞浸潤，脾臟白髓內(nèi)淋巴細胞輕度增生可見有淋巴細胞分裂相。免疫后1 周攻毒組死亡豬和陰性對照組所有豬出現(xiàn)典型的豬瘟病理學(xué)及組織病理學(xué)變化，如脾臟嚴重梗死、回盲瓣糜爛、扁桃體出血壞死、淋巴結(jié)出血腫大、腎和膀胱有廣泛性出血點；膀胱黏膜固有層內(nèi)有淋巴樣細胞浸潤灶，小血管有淤血，扁桃體淋巴細胞普遍性減少，小血管嚴重淤血，無明顯淋巴小結(jié)，腹股溝淋巴結(jié)出現(xiàn)機化灶，腎臟小血管淤血，腎小管有壞死崩解伴有淋巴樣細胞浸潤，脾臟紅髓內(nèi)有大量紅細胞，白髓淋巴細胞明顯減少伴有少量巨噬細胞浸潤等(表5)。

表4 熒光定量RT-PCR 檢測血液中病毒RNA 的存在Table 4 Detection of the viral RNA in the blood of the immunized pigs by real-time RT-PCR

表5 內(nèi)臟器官病理學(xué)(組織病理學(xué))變化Table 5 Organ tissues pathological lesions(histopathological lesions)

3 討論

本研究評價了嵌合載體豬瘟疫苗rAdV-SFV-E2最早提供完全保護的時間。結(jié)果顯示，該嵌合載體豬瘟疫苗最早于免疫后3 周能夠提供完全的攻毒保護，免疫后1～2 周能提供部分保護，但攻毒前在部分豬體內(nèi)并未檢測到豬瘟抗體的存在，攻毒后抗體迅速升高，并且能夠達到非常高的水平。研究顯示，C 株疫苗免疫后1 周就能夠完全抵抗CSFV 強毒株的攻擊，而此時也未檢測到豬瘟特異性抗體的存在，提供免疫保護作用的主要是細胞免疫(誘導(dǎo)了高水平的干擾素及其他細胞因子)。進而免疫該嵌合疫苗的豬在未檢測到豬瘟抗體的情況下，依然能夠抵抗CSFV 強毒株的攻擊，肯定是構(gòu)成嵌合載體的腺病毒和甲病毒復(fù)制子在細胞免疫中起到了重要作用。腺病毒載體是高效遞送外源基因的載體[10]，其遞送的復(fù)制子轉(zhuǎn)染細胞后，復(fù)制子RNA 具有感染性，可以直接作為mRNA，翻譯合成的非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1-4 為復(fù)制/轉(zhuǎn)錄酶，復(fù)制/轉(zhuǎn)錄酶控制載體RNA在胞漿中高水平復(fù)制，亞基因組mRNA 可以高水平表達外源基因。同時其RNA 復(fù)制酶合成大量雙鏈RNA(dsRNA)復(fù)制中間體，激活RNase L 和RNA 依賴的蛋白激酶(PKR)[11-12]，激活后的PKR 磷酸化NF-κB 抑制因子IκB 而活化NF-κB，誘導(dǎo)某些與凋亡相關(guān)的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[13]，dsRNA 還可激活并誘導(dǎo)樹突狀細胞的成熟[14]，增加樹突狀細胞等抗原遞呈細胞對凋亡細胞的攝取并遞呈給免疫系統(tǒng)[15]，dsRNA 還可被天然免疫受體(如Toll 樣受體3，TLR-3)識別，產(chǎn)生高水平的I 型干擾素(IFN-α 和IFN-β)或其它細胞因子[16]。該嵌合載體疫苗就是以腺病毒載體來遞送表達CSFV E2 蛋白的甲病毒復(fù)制子載體，這種疫苗既發(fā)揮了腺病毒載體的高效遞送外源基因的能力，又發(fā)揮了甲病毒復(fù)制子載體自我復(fù)制后高效表達外源基因及誘導(dǎo)強大細胞免疫應(yīng)答的優(yōu)勢。

總之，本研究表明rAdV-SFV-E2 能夠最早于免疫后3 周提供完全的攻毒保護，進一步確定了該疫苗能夠作為一株新型豬瘟標記疫苗株的可能性。該嵌合載體豬瘟疫苗較早誘導(dǎo)攻毒保護的機制有待于進一步研究。

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