郭 晶，李旭勇，鐘功勛，施建忠，李雁冰，陳化蘭

(中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

H5N1 亞型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)是嚴重威脅社會公共衛(wèi)生安全的人獸共患病病原。目前，H5N1亞型HPAIV 已在全球十幾個國家有感染人的報道，其致死率超過60 %，對人類的健康構成了極大的威脅[1]。此外，H5N1 亞型的HPAIV 經過在自然界長期的進化，已經開始具備對多種哺乳動物的感染甚至是致死能力[2-3]。通常，關于H5N1 亞型的HPAIV對小鼠致病力的研究一直都采用高劑量的病毒進行感染[4-6]，然而在自然界動物甚至是人類直接接觸到的病毒遠達不到這樣的劑量。因此，本研究模擬自然環(huán)境下小劑量HPAIV 感染小鼠，對該病毒在哺乳動物模型中致病力的研究具有重要的意義[7]。將兩株不同來源的H5N1 亞型HPAIV，低劑量感染小鼠后分析兩株病毒對小鼠的致病力差異、各器官中病毒復制滴度、病毒對組織的損傷等，為進一步了解自然環(huán)境中H5N1 亞型的HPAIV 感染哺乳動物后的發(fā)病進程提供了實驗參考。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要試劑 H5N1 亞型的HPAIV A/Anhui/2/05(AH/2/05)為一株人源分離株，A/Sichuan/81/05(SC/81/05)為一株禽源分離株，兩株病毒均屬于我國南方水禽H5N1 亞型的HPAIV Clade 2.3.4 分支[3]，由本研究所國家禽流感參考實驗室保存。所有涉及H5N1 亞型的HPAIV 的操作均在生物安全3級實驗室中進行。受體破壞酶(RDE)購自Sigma 公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；A 型流感病毒NP 單克隆抗體(MAb)由本實驗室制備。

1.2 動物實驗 6 周齡雌性BALB/c 小鼠經CO2輕度麻醉后，通過鼻腔接種10 EID50的病毒液。第一組感染病毒后每天稱量計算平均體重并觀察發(fā)病與存活情況。第二組分別于感染后不同時間點隨機抽取3 只存活小鼠，經CO2麻醉后迫殺，采集不同器官，按照文獻[3]方法分別進行病毒含量的滴定；同時分別于感染后的3 d、7 d 和10 d，隨機選取3 只小鼠迫殺，采集肺、腦和脾臟，進行組織病理學檢查。

1.3 病理學檢查 小鼠腦、脾臟、肺臟分別經10%中性福爾馬林溶液固定后，按常規(guī)包埋，制備石蠟切片，HE 染色后鏡檢。同時利用MAb，采用免疫組化試劑盒，按照說明書進行組織切片的免疫組化染色，檢測組織細胞中的病毒抗原。

1.4 中和抗體測定 小鼠感染后的7 d、14 d 和21 d采血，分離血清，血清經過RDE 于37 ℃作用過夜，56 ℃滅活30 min。病毒經滅活劑滅活后配備4 單位抗原。處理的血清加入到96 孔V 型血凝板，并作2倍倍比稀釋到212，加入到預配的4 單位抗原，輕微震蕩96 孔血凝板，使抗原和抗體充分反應，室溫靜置30 min，加入0.5%的雞紅細胞，室溫下作用15 min，觀察并記錄血凝結果。

2 結果

2.1 小鼠的發(fā)病和死亡情況 兩株病毒AH/2/05 和SC/81/05 以10 EID50的劑量經鼻腔感染小鼠后連續(xù)14 d 稱重觀察，結果表明兩株病毒對小鼠的致病力差異顯著。AH/2/05 感染組的5 只小鼠在感染后的4 d即有一只小鼠死亡，至感染后的14 d 僅有一只小鼠存活。感染后的7 d 內體重和臨床癥狀無明顯變化，一周之后小鼠體重逐漸減輕，開始表現出嚴重的臨床癥狀，主要表現為食欲下降、呼吸急促，以及共濟失調、顫抖、運動遲緩等神經癥狀。至感染后的14 d 平均體重約下降到初始體重的90 %，超過半數的小鼠最終死亡，耐過的小鼠表現出輕微的神經癥狀。而SC/81/05 感染組的5 只小鼠無死亡，感染后平均體重逐步上升，至感染后14 d，其體重約上升至初始體重的115 %(圖1)。

圖1 AH/2/05 和SC/81/05 感染后14 d 小鼠體重變化(A)和存活情況(B)Fig.1 Weight change(A)and survival(B)of mice after inoculated with AH/2/05 and SC/81/05 viruses

2.2 病毒在體內的復制 以10 EID50劑量的病毒感染小鼠，感染后的3 d、5 d、7 d、10 d 和14 d 迫殺小鼠，取小鼠的腦、鼻甲、鼻相關淋巴組織(Nasal-associated lymphoid tissue，NALT)、脾臟、腎臟、肺臟進行病毒滴定。AH/2/05 感染小鼠后可以在小鼠的各個組織臟器中分離到高滴度的病毒。小鼠的肺臟在感染后3 d、5 d、7 d、10 d 和14 d 均能檢測到病毒，在感染后7 d 病毒滴度最高達到107.0EID50/mL，在感染后14 d 病毒滴度下降到101.75EID50/mL。在感染后的7 d 小鼠的鼻甲病毒含量最高，是排毒的高峰，而在感染后的其他時間段則基本不排毒或很少排毒。同時，在感染后5 d、7 d 和10 d 在小鼠的NALT 中分離到病毒。脾臟和腎臟中病毒在感染后的5 d 和7 d 滴度較高，其它時間段基本檢測不到病毒。在感染后的10 d 腦組織中的病毒滴度達到105.75EID50/mL，并且在第14 d 仍然可以檢測到病毒。與AH/2/05 感染組截然不同，SC/81/05感染小鼠后，僅可以在感染后的3 d～5 d 小鼠的肺臟中分離到少量的病毒，其它臟器和組織均未檢測到病毒(圖2)。

圖2 兩株病毒感染小鼠后不同時間體內各臟器的病毒滴度Fig.2 Viral replication in different organs of mice at different time post infection with two viruses

2.3 組織病理學變化 被AH/2/05 感染的小鼠的肺組織病理切片中，觀察到病毒對內臟器官造成了嚴重損害。感染初期肺臟無明顯的病理變化，感染后的5 d 至14 d 肺臟呈現嚴重的病變，包括充血、滲出、實變、肺泡腔縮小、肺泡間隔增寬，以及大量的單核細胞滲出。在SC/81/05 感染組的小鼠臟器組織病理切片中，未觀察到嚴重的病理變化。僅在感染后3 d 觀察到肺泡腔輕微的縮小，肺泡間隔輕度增寬，在感染后的5 d、7 d、10 d 和14 d 肺組織恢復到正常狀態(tài)，無明顯病理變化(圖3)。通過免疫組化檢測，AH/2/05 感染組的小鼠在感染后3 d 可以在肺臟、脾臟、腦組織中均檢測到大量病毒抗原，而SC/81/05 感染組的小鼠在感染后的3 d 僅在肺臟中可以檢測到病毒抗原，脾臟和腦組織中未檢測到病毒抗原(圖4)。

圖3 兩株病毒感染后不同時間小鼠肺臟的組織病理學變化Fig.3 Histological lesions in lungs at different time post infection with two H5N1 viruses

圖4 免疫組化檢測不同組織中的病毒抗原結果Fig.4 Immunohistochemical detection of virus antigen in different organs of the infected mice

2.4 中和抗體水平 感染后7 d、14 d 和21 d 采集小鼠的血清，測定病毒的中和抗體水平。結果顯示，AH/2/05 和SC/81/05 兩個感染組的小鼠血清中的中和抗體水平差異較大。AH/2/05 組的小鼠在感染后的兩周血清抗體水平相對較高，平均水平為260～320，在感染后3 周血清中的中和抗體水平稍有下降為213。而SC/81/05 感染組的小鼠在感染后的1 周血清抗體水平較低約133，感染后的2 周至3周血清中的抗體水平較高為266(圖5)。

圖5 AH/2/05 和SC/81/05 感染后3 周小鼠血清中HI 的抗體水平變化Fig.5 Serum HI antibody change of infected mice post inoculated with AH/2/05 and SC/81/05 influenza viruses at day 7,14 and 21

3 討論

目前，由于小鼠是研究流感病毒一個比較理想的哺乳動物模型，國內外許多關于H5N1 亞型HPAIV 對哺乳動物致病性的研究都采用小鼠模型進行[6-8]。在關于HPAIV 對哺乳動物的致病性研究中，采用低劑量的H5N1 HPAIV 感染小鼠能夠更接近于宿主自然感染的狀態(tài)，為人們提供了新的研究思路，有助于更真實的研究HPAIV 感染哺乳動物后，病毒在宿主體內的復制過程，對宿主各個臟器的損害情況，宿主體內抗體和細胞因子等的變化。

人源病毒AH/2/05 和禽源病毒SC/81/05 是H5N1亞型HPAIV，屬于我國南方水禽系禽流感病毒群，為Clade2.3.4 分支[3]。本研究選取了這兩株病毒，采用低劑量對小鼠進行感染試驗，結果顯示AH/2/05 在哺乳動物模型小鼠體內的有效復制能力長達14 d，該病毒對神經系統(tǒng)有極強的組織嗜性，并且對小鼠有高度的致死能力；而SC/81/05 在小鼠體內局限性復制，僅于3 d～5 d 在小鼠的肺臟檢測到病毒，組織臟器沒有明顯損傷，不引起小鼠臨床癥狀，不造成小鼠死亡。兩株病毒AH/2/05 和SC/81/05 序列分析，結果顯示它們的基因組高度同源，僅有27 個氨基酸不同，但對小鼠致病力截然不同，這為進一步研究HPAIV 致病機制奠定了實驗基礎。此外，本研究將我國的AIV Clade2.3.4 亞群的代表株AH/2/05 對哺乳動物模型小鼠的致病力進行了系統(tǒng)分析，證明了該病毒對哺乳動物具有非常強的感染、復制和致死能力，為我國防止該亞群病毒在我國的擴散以及研究人類在感染HPAIV 后的病理進程提供了相關的依據。

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