陳惠云，孫志棟，吳峰華，楊虎清

（1.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,浙江寧波 315040；2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江臨安 311300）

乙烯、1-MCP對(duì)毛竹春筍老化和ERS1基因表達(dá)的影響

陳惠云1，孫志棟1，吳峰華2，楊虎清2

（1.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,浙江寧波 315040；2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江臨安 311300）

毛竹春筍采收后在20℃條件下用外源乙烯和1-MCP處理,研究乙烯和1-MCP對(duì)采后毛竹春筍木質(zhì)化的調(diào)控作用。結(jié)果表明,乙烯處理提高了木質(zhì)素合成相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）的活性和ERS1基因的表達(dá),促進(jìn)組織中木質(zhì)素和纖維素的積累,加快了毛竹春筍采后老化；1-MCP處理顯著降低了PAL、CAD和POD活性以及ERS1基因的表達(dá)水平,抑制了木質(zhì)素和纖維素的積累,延緩了毛竹春筍采后木質(zhì)化。推測(cè)毛竹春筍ERS1對(duì)乙烯信號(hào)是一種正調(diào)控模式,乙烯通過調(diào)控ERS1基因表達(dá)而影響毛竹春筍組織老化進(jìn)程。

毛竹春筍；乙烯受體基因；cDNA克?。灰蚁?；1-MCP；木質(zhì)化

1 材料與方法

1.1 材料與處理

毛竹（Phyllostachys pubescens Mazel）春筍采自浙江省余姚市馮村,采收當(dāng)天選取筍長(zhǎng)在35 cm,基徑在8 cm左右的春筍,隨機(jī)分成3組,每組60支。將毛竹春筍洗凈去殼,切除底部老蔸,用0.04%的NaClO溶液浸泡3 min,在通風(fēng)處晾干。然后放入箱內(nèi)放置有100 m L 1 mol的NaOH溶液200 L的密閉容器中,用不同藥劑進(jìn)行處理。

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：處理1空白對(duì)照（CK）,不用藥劑；處理2用1μL·L-11-MCP；處理3用500μL·L-1乙烯。處理溫度為20℃,處理時(shí)間均為8 h,重復(fù)3次。處理后置于恒溫20℃,相對(duì)濕度80%～85%,自然光的室內(nèi),任其自然老化。每隔24 h從基部向頂端15 cm處取樣。樣品用液氮冷凍,保存于-80℃的超低溫冰箱中,用于隨后的RNA提取和生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 乙烯釋放量

取3個(gè)毛竹春筍在20℃、5 L容器內(nèi)密閉1 h,抽取1 m L氣樣用SP6800A氣相色譜儀（山東魯南瑞虹化工儀器有限公司）測(cè)定乙烯含量,重復(fù)3次。氣譜條件：氫焰離子化檢測(cè)器, GDX502填充柱,載氣、燃?xì)?、助燃?xì)夥謩e為N2、H2和空氣,柱溫100℃,檢測(cè)溫度100℃,進(jìn)樣溫度120℃。

1.2.2 竹筍硬度

用TA-XT2 i型質(zhì)構(gòu)儀測(cè)毛竹春筍中部硬度,探頭直徑為5 mm,測(cè)試深度為6 mm,貫入速度為1 mm·s-1,取最大值,重復(fù)10次取平均值。

P21對(duì)HoxB4的調(diào)控機(jī)制及其影響造血干細(xì)胞增殖初步研究 … ……………… 李雪華，等(6):636

1.2.3 木質(zhì)素和粗纖維含量

木質(zhì)素和粗纖維含量測(cè)定分別參考鞠志國(guó)等［5-6］的方法并加以改進(jìn)。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）活性測(cè)定

稱取5.0 g竹筍樣品置于研缽中,加入10 m L 0.05 mol·L-1pH值7.8的磷酸緩沖液（含4% PVP,2 mmol·L-1EDTA和5 mmol·L-1巰基乙醇）,冰浴條件下研磨,將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中,于4℃、12 000 r·min-1離心20 min,收集上清液,即為酶液。PAL參照Z(yǔ)ucker［7］的方法測(cè)定, CAD參照Mansell等［8］的方法測(cè)定,POD參考Kochba等［9］的方法測(cè)定。

1.3 ERS l基因表達(dá)

毛竹春筍總RNA提取采用TRIzol Kit及其說(shuō)明書提供的方法。根據(jù)克隆的毛竹春筍乙烯受體基因ERS1和ACTIN序列,利用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物（ERS1：5′-GATGCTTACCCATGAAATCAGAAGCAC-3′和5′-CTGACAAACCTCTTGCAAATGGCAAG-3′；ACTIN：5′-GACAATGGCACTGGAATGGTCA-3′和5′-GCTCCTGCTCATAATCAAGGGC-3）,委托上海Sangon生物技術(shù)公司合成。RNA的反轉(zhuǎn)錄參照Fermentas公司的M2MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)根據(jù)Taq DNA聚合酶產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃4 min；94℃45 s,54℃30 s,72℃1 min；72℃10 m in。35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖/TAE電泳檢測(cè)。電泳條帶用Band leader 3.0圖像軟件分析,以目的基因與內(nèi)參基因的電泳帶平均光密度的比值作為基因表達(dá)的相對(duì)數(shù)值,重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯釋放量和硬度變化

如圖1中A所示,常溫下對(duì)照處理毛竹春筍的乙烯釋放量緩慢上升,采后2 d達(dá)到最大,然后逐漸下降；乙烯處理促進(jìn)了毛竹春筍的乙烯釋放量,始終顯著高于對(duì)照和1-MCP處理的毛竹春筍；1-MCP處理抑制了毛竹春筍乙烯生成,在采后3 d內(nèi),其乙烯釋放量顯著低于對(duì)照和乙烯處理的毛竹春筍。圖1中B顯示,采后毛竹春筍的組織硬度均呈上升趨勢(shì),乙烯處理毛竹春筍硬度快速上升且顯著高于對(duì)照,而1-MCP處理抑制了毛竹春筍硬度的增加。

2.2 纖維素和木質(zhì)素含量

圖1 各處理春筍的乙烯釋放量和硬度變化

圖2 各處理春筍的木質(zhì)素和纖維素含量變化

圖2 顯示,毛竹春筍采后20℃下的老化過程中,毛竹春筍木質(zhì)素和纖維素含量均呈增加趨勢(shì),乙烯和1-MCP處理毛竹春筍的變化趨勢(shì)與對(duì)照相似,但1-MCP處理顯著抑制了木質(zhì)素和纖維素的合成,4 d后木質(zhì)素和纖維素比對(duì)照減少12.1%和8.2%,而乙烯處理則促進(jìn)了毛竹春筍木質(zhì)素和纖維素的積累,分別比對(duì)照高8.3%和9.2%。

2.3 PAL、CAD和POD活性

毛竹春筍采后在20℃環(huán)境中組織的PAL活性呈現(xiàn)峰型變化,貯藏前期PAL活性迅速上升,于采后3 d達(dá)到高峰,之后趨于下降（圖3中A）；而CAD和POD活性是持續(xù)上升的,但后2 d上升趨于緩慢（圖3中B和C）。乙烯處理提高了PAL、CAD和POD活性,始終高于對(duì)照水平,而1-MCP處理均有效地抑制APL、CAD和POD的活性。

2.4 ERS l基因的表達(dá)

如圖4所示,毛竹春筍經(jīng)外源乙烯處理后,與對(duì)照相比,能夠顯著促進(jìn)組織中ERS1基因的表達(dá),加速毛竹春筍木質(zhì)化,而1-MCP處理則明顯抑制ERS1基因的表達(dá),從而延緩了毛竹春筍組織的老化。

圖3 各處理春筍的PAL、CAD和POD活性變化

圖4 各處理春筍的ERS1表達(dá)變化

3 小結(jié)與討論

竹筍采后易木質(zhì)化。植物木質(zhì)化作用是木質(zhì)素單體經(jīng)聚合反應(yīng)形成木質(zhì)素大分子沉積在細(xì)胞壁的過程,組織木質(zhì)化是細(xì)胞次生壁形成的主要特征之一,木質(zhì)素單體合成則是木質(zhì)化作用的中心［10］。提高PAL、CAD或POD酶活性可顯著增加植物組織木質(zhì)素含量［11］。通過反義RNA技術(shù)抑制這些酶的活性,均能夠改變木質(zhì)素的含量和構(gòu)成［12］。本試驗(yàn)中,采用乙烯處理促進(jìn)毛竹春筍的乙烯釋放,提高了PAL、CAD和POD活性,顯著增加了毛竹春筍組織中木質(zhì)素和纖維素的積累,加速了毛竹春筍老化。而1-MCP處理則降低了采后毛竹春筍的乙烯釋放速率,抑制了PAL、CAD和POD活性以及木質(zhì)素和纖維素的合成,延緩了老化,這和羅自生等［3］的研究結(jié)果一致。

乙烯調(diào)控毛竹春筍老化與受體基因表達(dá)有關(guān)。在乙烯信號(hào)傳導(dǎo)過程中,植物激素乙烯只有與受體結(jié)合,通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo),才能誘導(dǎo)植物衰老反應(yīng)［13］。在擬南芥中乙烯的感受包括5個(gè)與膜結(jié)合的乙烯受體基因（ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4）,并且乙烯受體是乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子［14］。從番茄果實(shí)中已分離出6個(gè)乙烯受體基因［15］。本試驗(yàn)克隆了毛竹春筍乙烯受體基因ERS1,并分析了ERS1對(duì)乙烯和1-MCP處理的相應(yīng)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)ERS1對(duì)乙烯信號(hào)表達(dá)上調(diào),對(duì)1-MCP表達(dá)下降,因此,推測(cè)毛竹春筍ERS1對(duì)乙烯信號(hào)是一種正調(diào)控模式,賀立紅等［16］也報(bào)道香蕉ERS1對(duì)乙烯是正調(diào)控。乙烯和1-MCP通過調(diào)控ERS1基因表達(dá)而影響毛竹春筍組織老化進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯：張才德）

S 644.2

A

0528-9017（2014）03-0336-03

文獻(xiàn)著錄格式：陳惠云,孫志棟,吳峰華,等.乙烯、1-MCP對(duì)毛竹春筍老化和ERS1基因表達(dá)的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（3）：336-338,343.

2013-12-19

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012A610134）；寧波市農(nóng)業(yè)重大（重點(diǎn)）擇優(yōu)委托科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012C10018）

陳惠云（1980-）,女,浙江余姚人,農(nóng)藝師,主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究工作。E-mail：chhyun@163.com。

楊虎清。E-mail：yanghuqing@sohu.com。