高志強，張鶴曉，蒲 靜，張 偉，谷 強，喬彩霞，張利峰，汪 琳

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 通州101113）

H7亞型禽流感病毒可引起高致病性禽流感，因此OIE手冊將所有H7亞型禽流感列為需通報的疫病[1]。我國尚未發(fā)生由H7亞型禽流感引起的高致病性禽流感，但禽群中可能存在低致病性H7亞型禽流感病毒。2013年3月，我國發(fā)生人感染H7N9禽流感病毒的病例，病毒基因序列分析顯示，該病毒為全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒，目前盡管對該疫病的感染來源還不清楚，但已從活禽交易市場多次檢測到H7N9亞型禽流感病毒。目前確診本病除采用傳統(tǒng)的雞胚病毒分離方法外，常采用核酸檢測方法進行禽流感病毒H7亞型快速分型檢測。

為規(guī)范禽流感病毒核酸檢測的質(zhì)控問題，本研究參考相關標準物質(zhì)的研制方法以及統(tǒng)計方法[2-3]，針對H7亞型禽流感病毒最具有檢測意義的HA片段，在擴增克隆的基礎上，體外轉(zhuǎn)錄全長RNA。經(jīng)聯(lián)合定值和不確定分析制備出禽流感病毒H7亞型核酸檢測的標準樣品。此外，首次采用MGB修飾的雙簡并探針建立了Taq Man熒光RT-PCR檢測技術，并使用制備的標準樣品對方法的檢測限進行了測定。

1 材料與方法

1.1 試劑

1.1.1 病毒核酸 本研究中涉及的病毒核酸包括A/Chicken/1/2002（H7N1），A/Shanghai/1/2013（H7N9），A/Swine/1/2003（H1N1），A/equine/HB/1/07（H3N8），A/Swine/2003/GD（H3），A/Swine/2003/2（H3），A/Chicken/JL（H3），A/Chicken/JL（H4），6株H5N1、1株H9亞型禽流感病毒核酸以及2株新城疫病毒核酸（LaSota和F48E9）。

1.1.2 主要試劑 TRIZol，購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑以及體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Promega公司。pMD20-T載體克隆試劑盒，One Step RNA PCR Kit，MiniBEST Plasmid Purification以及DNA Fragment Purification Kit，購自TaKaRa公司。

1.1.3 實時熒光定量PCR儀 LightCycler，Roche公司產(chǎn)品。

1.2 H7亞型禽流感病毒HA基因的擴增、克隆和序列分析 設計以下1對引物，用于擴增病毒含完整HA ORF的基因片段。

表1 擴增H7亞型禽流感病毒HA基因的引物名稱、序列

應用One Step RNA PCR Kit經(jīng)一步法RT-PCR擴增全長HA基因片段，反應條件為50℃30min，94℃2min；94℃30 s，50℃30 s，72℃2min，30個循環(huán)。將目的片段克隆于pMD20-T載體。

1.3 體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA制備標準樣品 選用Smal I對質(zhì)粒線性化。經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄制備RNA純品。根據(jù)260 nm和280 nm的吸光度值測算其RNA拷貝數(shù)，應用RNA保存液（TRIZol：水＝3∶1）稀釋RNA至108拷貝數(shù)/μL后分裝，0.5m L/管。

1.4 標準樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢驗 隨機抽取10管制備的標準品，提取RNA。測定拷貝數(shù)，用單因子方差分析進行統(tǒng)計[2]。分別于0、0.5、6、12個月以及24個月隨機抽取制備的標準品提取RNA。測定拷貝數(shù)，經(jīng)回歸分析確定其不確定度，采用t檢驗確定其穩(wěn)定性[2]。

1.5 標準品協(xié)作標定和不確定度分析 聯(lián)合8家實驗室對制備的標準品進行定值，取其平均值作為定值結(jié)果。對標準品的各個不確定度分量進行合成[2]。

1.6 分型檢測引物與探針的設計 在多重序列比對的基礎上，設計1對引物和2條MGB探針，對設計的引物和探針經(jīng)BLAST進行驗證，序列見表2。

表2 引物、探針的名稱及序列

1.7 H7亞型雙探針熒光RT-PCR反應體系的建立與優(yōu)化 使用1∶104稀釋的H7亞型禽流感病毒RNA，對反應體系中的引物、探針、Mg2+以及dNTP濃度進行優(yōu)化，確定最佳反應參數(shù)。

1.8 靈敏度、特異性和重復性試驗 對制備的cRNA標準品以10倍梯度稀釋后,按最佳條件進行測定,確定檢測極限。對1.1.1中的病毒核酸樣品進行檢測，分析方法的特異性。選3個不同濃度的cRNA模板,用熒光RT-PCR方法連續(xù)檢測3次，并計算變異系數(shù)，驗證方法的重復性。

1.9 對臨床樣品的檢測驗證 對已知禽拭子樣品586份進行檢測。在實際樣品中驗證方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 H7亞型禽流感病毒HA基因的擴增、克隆和測序 擴增HA基因結(jié)果見圖1。擴增片段克隆入pMD20-T載體，測序鑒定后命名為pMD20-THA（H7N1）。

圖1目的片段RT-PCR擴增結(jié)果

2.2 體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA制備標準品 制備的體外轉(zhuǎn)錄RNA，經(jīng)測定結(jié)果顯示，A260和A280的比值均在2.0±0.1范圍內(nèi)，表明RNA純度較高。

2.3 均勻性檢驗結(jié)果 采用單因子方差分析確定瓶間均勻性。管（瓶）間方差：

因此管（瓶）間標準偏差為：

2.4 穩(wěn)定性研究結(jié)果 與斜率相關的不確定度為：

自由度為3和P=0.95（95%置信水平）的t分布值為3.18。

因 ||b1〈t0.95，n-2·s（ ||b1）故斜率不顯著，說明制備的標準物質(zhì)候選物穩(wěn)定。而-80℃保存24個月的長期穩(wěn)定性的不確定度貢獻為：

ults=sb·t=4.316×104×24=1.036×106Copies/μL。

2.5 聯(lián)合定值研究 對8組獨立的數(shù)據(jù)進行分析?？偲骄禐椋?/p>

經(jīng)單因子方差分析?？偲骄档牟淮_定度為：

定值結(jié)果：H7亞型動物流感病毒HA基因RNA含量為1.015×108Copies/μL，測定不確定度為6.607×105。

2.6 標準樣品的不確定度合成 通過合成測定、均勻性和穩(wěn)定性的不確定度的貢獻來估算H7亞型禽流感病毒核酸標準品候選物的總不確定度。

因此H7亞型禽流感核酸標準品候選物的量值可以表示為（1.015±0.016）×108Copies/μL。

2.7 熒光定量RT-PCR的反應條件的優(yōu)化結(jié)果

最適反應總體積25μL，其中模板10.0μL；引物濃度為0.4μmol/L，探針濃度為0.15μmol/L，Mg2+濃度為6mmol/L；最適循環(huán)參數(shù)為42℃30min，94℃3min；之后92℃15 s，53℃10 s，60℃35 s，40個循環(huán)。

2.8 靈敏度、特異性和重復性試驗結(jié)果 將標準品RNA稀釋為105copies/10μL～101 copies/10μL進行檢測，結(jié)果顯示，建立的檢測方法的檢測限可達10 copies，圖2為檢測限測定結(jié)果。建立的方法與1.1.1所述病毒核酸不發(fā)生交叉反應。對3個不同濃度的cRNA標準模板,用所建立的熒光RT-PCR方法連續(xù)檢測3次,統(tǒng)計各組Ct值的變異系數(shù)（CV%），均小于5%。

圖2 H7檢測方法的檢測極限測定

2.9 建立方法對臨床樣品的檢測結(jié)果 應用建立的方法對586份拭子樣品進行檢測。檢出2份H7亞型陽性熒光RT-PCR樣品，經(jīng)與普通RTPCR檢測方法（《SN/T 1182-2010禽流感檢疫技術規(guī)范》）進行比較，結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

針對H7亞型禽流感病毒，目前國內(nèi)外已經(jīng)研制出許多核酸檢測方法，但缺乏參比品進行評價和驗證。本研究針對H7亞型流感病毒最具分型檢測意義的HA基因全長核酸片段制備出標準品并進行了均勻性和穩(wěn)定性研究。由于該標準品為RNA，在實際檢測中具有很好的適用性。不僅可用于評定實驗室鑒別診斷H7亞型禽流感病毒核酸的能力，還可用于實驗室進行質(zhì)量控制和量值傳遞提供參比品。

目前國內(nèi)外已建立了一些基于Taq Man的熒光RT-PCR檢測方法用于H7亞型分型檢測[4-5]。在本研究中，通過對大量的序列比對，找出在禽流感病毒H7 HA基因間保守和特異的序列進行引物探針設計。由于HA基因的高度變異性，1套引物探針很難覆蓋各種H7亞型毒株，因此使用1對簡并引物和2條MGB探針來保證方法對不同來源H7亞型病毒的通用性，進而建立了H7亞型禽流感病毒Taq Man熒光RT-PCR檢測方法。運用優(yōu)化后的方法檢測制備的標準樣品，結(jié)果顯示，檢測極限可達10Copies，特異性和重復性良好，并使用臨床樣品進行了驗證。

[1]Office International des Epizooties.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[M].Paris：Office International des Epizooties，2008：1128-1138.

[2]全國標準樣品技術委員會.標準樣品的工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法[M].北京：中國標準出版社，GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35：2006.

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