鄭翠玲，向 華，黃 元，陳 晶，王曉虎，宣 華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州510640；2.唐山職業(yè)技術學院，河北 唐山064003）

貓杯狀病毒（Feline Calicivirus，F(xiàn)CV）是貓科動物的一種高度傳染性病原，能引起貓的口腔或上呼吸道感染，有的毒株還能導致跛行。高玉偉[1]等從我國野生動物中分離到貓杯狀病毒（FCV），這表明貓杯狀病毒對野生珍稀動物的健康造成了極大的威脅。

FCV屬于杯狀病毒科（Caliciviridae）杯狀病毒屬（Calicivirus）。盡管此類病毒早已發(fā)現(xiàn)，但由于缺乏相應的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，導致對其分子生物學特性的研究進展緩慢。貓杯狀病毒是杯狀病毒科中惟一可在體外成功培養(yǎng)的病毒[2]。隨著反向遺傳學技術的發(fā)展，許多正鏈RNA病毒的研究取得重大進展[3]。本研究旨在建立FCV感染性克隆，構建嵌合載體，進而研究其他杯狀病毒生物學特性和致病機理。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞、質粒及菌種 FCV病毒液和質粒PFCV＋T由廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存；La Taq DNA聚合酶、反轉錄酶AMVRT、限制性內(nèi)切酶Sma I、Sph I Mlu I、DNA凝膠回收試劑盒均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2 000 Reagent、LSTRIZol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；高純度質粒提取純化試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)用MEM、新生小牛血清均為GIBOCOBRL公司產(chǎn)品。

1.2 引物設計 參照已經(jīng)獲得的FCV CH-GD株全基因組序列[4]，設計了擴增FCV全基因的2對引物，在其中1對引物中引入Sma I，Sph I酶切位點和T7啟動子核心序列，在另1對引物中引入一個突變位點，形成一個新的酶切位點Mlu I，兩對引物序列如下：

P1：5′-CAGCCCGGGTAATACGACTCACTATAG TAAAAGAAATTTGAGACAATG-3′；P2：5′-GGAACGCGTGTCTATATGCAAGC-3；P3：5-GGAACGCGTGTCTATATGCAAGC-3′；P4：5′CTGCATGCTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTGGGGTTAGGCGC-3′。引物由上海Invitrogen生物技術有限公司合成。

1.3 聚合酶鏈式反應（PCR） 用已經(jīng)獲得的質粒PFCV＋T為模板進行PCR擴增。FCV長片段P5.2的擴增：反應總體積為50μL。反應條件：預變性95℃5min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃5 min 30 s，進行30個循環(huán)后，最后72℃延伸10min。FCV短片段P2.6的擴增：反應總體積為50μL。預變性94℃30 s，退火57℃30 s，延伸72℃5min 30 s，進行30個循環(huán)后，最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4 重組PCR 以PCR產(chǎn)物P5.2和P2.6混合液為模板，P1和P4為上下游引物，用重組PCR方法擴增FCV的全基因組。反應總體積為50μL。預變性95℃7min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃8min，進行30個循環(huán)后，最后72℃延伸10min。重組PCR產(chǎn)物用酶切鑒定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結果。

1.5 連接、轉化及陽性克隆質粒的鑒定 將鑒定正確的重組PCR產(chǎn)物與pMD20-T載體連接，轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)，并進行陽性克隆質粒的鑒定。陽性質粒命名為P′FCV＋T，其菌液送Invitrogen公司進行序列測定。

1.6 體外轉錄 用Sma I酶將全長cDNA克隆質粒P′FCV＋T切開使其線性化，用RibomaxTM體外轉錄試劑盒（Promega）進行體外轉錄反應。1組加Ribom7G Cap Analog，2組不加Ribom7GCap Analog。

1.7 體外轉染 用1μg的RNA和10μL脂質體混合，分別加100μL Opti-MEMI細胞培養(yǎng)液，孵育30min，用800μLOpti-MEMI稀釋后加到事先準備好的F81細胞上。37℃作用5 h，吸棄轉染液，加入含10%FCSMEM培養(yǎng)液（不含抗生素）。在37℃，5%CO2下培養(yǎng)24～48 h，觀察具有FCV致病特點的細胞病變（CPE）。同時作陰性、陽性對照。陰性對照設兩個：1個為正常培養(yǎng)的細胞對照，1個為不加帽狀物的轉錄產(chǎn)物的細胞對照。陽性對照病毒按100 TCID50接毒。觀察結果。

1.8 FCV感染性克隆的鑒定 將轉染后獲得的病毒液接種新的F81細胞，當細胞100%出現(xiàn)病變時，收毒，再用獲得的病毒液接種新的F81細胞，如此連續(xù)傳5代。從最后一次收集的病毒液中提取病毒RNA。進行RT-PCR試驗。PCR產(chǎn)物用Mlu I酶切鑒定。

2 結果

2.1 PCR結果 以質粒PFCV＋T為模板，分別進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到2.6 kb和5.2 kb兩個片段，大小與預期相符。

2.2 重組PCR及酶切鑒定 用重組PCR方法擴增FCV的全基因組。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得7.6 kb的目的條帶。用Mlu I酶酶切鑒定7.6 kb的條帶，1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)2.6 kb和5.2 kb的兩條帶，與預期相符。

2.3 質粒的酶切鑒定 經(jīng)重組PCR擴增獲得的FCV全基因片段與pMD20-T載體連接，轉化JM109感受態(tài)，提取重組質粒，用Sma I單酶切鑒定質粒。將獲得的正向連接質粒命名為P′FCV＋T。用Mlu I酶單酶切鑒定質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果與預期值相符，得到一條10.3 kb的目的條帶。

2.4 體外轉錄 用RibomaxTM體外轉錄試劑盒Promega對線性化的質粒進行體外轉錄反應。用RNase-Free DNase去除冗余的DNA，經(jīng)分光光度計測定，RNA濃度為0.5μg/mL，轉錄成功。

2.5 體外轉染 將體外轉錄獲得的RNA用脂質體轉染F81細胞。5′端加帽狀結構的RNA所轉染的F81細胞48 h后出現(xiàn)典型的FCV感染病變，而5′端不加帽狀結構的RNA所轉染的F81細胞則無病變發(fā)生（圖2、3、4、5）。

2.6 感染性克隆的鑒定 為確定病毒來源于全長cDNA克隆，在5 121位引入一個突變，由此產(chǎn)生一個新的酶切位點Mlu I，構建含有突變點的全長cDNA克隆，基因序列測誘導突變成功。

3 討論

圖1 PCR及酶切鑒定

圖2 陰性對照：正常F81細胞（200×）

圖3 陰性對照：不加帽狀結構（100×）

圖4（A，B）陽性對照F81細胞（A：200×；B：400×）

圖5 轉染48 h后細胞出現(xiàn)病變（A：400×；B：400×）

3.1 關于感染性克隆的構建 本研究的目的是構建FCV的感染性克隆載體。FCV是目前除豬水皰疹病毒（自1959年美國最后一次發(fā)生以來，除在海洋哺乳動物和魚類中仍有這種病毒存在外，就再未發(fā)現(xiàn)過這種病毒，國內(nèi)也未見報道）外，惟一可在細胞培養(yǎng)上增殖的杯狀病毒。因此構建FCV感染性克隆對杯狀病毒的研究有十分重要的意義。Kyeong-OK Chang[5]成功恢復了具有感染性的豬的杯狀病毒。Jorg Oliver Thumfart[6]等采用體外轉錄的方法和構建真核表達質粒的方法，成功恢復了FCV病毒粒子。但國內(nèi)對此報道甚少。

鑒于FCV基因組比較長，基因組結構復雜，因此在試驗中采用先分段擴增，再用重組PCR法擴增全長的策略。重組PCR技術的使用成功解決了用分段擴增的各片段因無合適的酶切位點而無法用DNA聚合酶將其連接起來的難題。新引物序列上游序列中加入了單一的核酸內(nèi)切酶Sma I酶切位點和T7啟動子的核心序列，下游引物序列中加入了核酸內(nèi)切酶Sph I的酶切位點。引物中引入的單一的核酸內(nèi)切酶，使FCV cDNA克隆能方便的進行線性化，進而進行體外轉錄和轉染。T7啟動子的引入保證了轉錄的正確起始。本研究構建了FCV的感染性克隆，并對其病毒滴度進行了測定，其致細胞出現(xiàn)病變的時間及病毒滴度與野生型FCV相比無差異。這說明FCV感染性克隆構建成功，為下一步研究其生物學特性、毒力因子、致病機理以及嵌合載體的構建打下了基礎。

3.2 關于VPg蛋白 杯狀病毒基因組5′端無帽狀結構，而是與小RNA病毒一樣具有VPg蛋白。但與小RNA病毒不同的是杯狀病毒的VPg為感染所必需。因而從FCV全長cDNA克隆體外轉錄的病毒RNA是否需要VPg樣結構才具有感染性是一個非常關鍵的問題。本研究中將5′端加帽狀物組與5′端不加帽狀物組同時進行體外轉錄和轉染，結果5′端加帽狀物組在轉染F81細胞48 h后出現(xiàn)典型的FCV感染病變，而未加帽狀物組則無病變出現(xiàn)。這表明5′端帽狀結構可以代替VPg起作用。體外轉錄的FCV RNA加5′端帽狀結構就具有感染性，而不加此結構就不具有感染性。

[1]高玉偉，夏咸柱，扈榮良.獵豹與虎貓杯狀病毒的分離及其超變區(qū)基因比較研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（3）：179-182.

[2] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：519-531

[3]祁國財，李平花，劉在新.反向遺傳學技術在新型疫苗研制中的應用[J].中國預防獸醫(yī)學報，2012，34（10）：841-844.

[4]鄭翠玲，向華，宣華，等.貓杯狀病毒全基因組的克隆及序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010（3）：109-111.

[5] Kyeong-OK Chang，Stanislav S.Sosnovtsev，et al.Reverse genetic system for porcine enteric calicivirus，a prototype sapovirus in the caliciviridae[J].Journal of virology，2005，79（3）：1049-1416.

[6]Jorg Oliver Thumfart，Gregor Meyers.Feline calicivirus：recovery of wild-type and recombinant viruses after transfection of cRNA orcDNA constructs[J].Journal of virology，2002，76（12）：6398-6407.