游思湘，符晨星，瞿俊勇，劉湘新

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南 長沙410128）

復(fù)方魚腥草制劑是以魚腥草為主藥，輔以黃芩、連翹、金銀花和板藍(lán)根等4味中藥組成的復(fù)方制劑。配方中的魚腥草具有清熱解毒、排痛消腫療瘡、利尿除濕、健胃消食等功效[1]；黃芩有清熱燥濕、涼血安胎、解毒功效[2]；連翹具清熱解毒、消腫、散結(jié)的功效[3]；金銀花具有廣譜抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等致病菌均有較強(qiáng)的抑制作用[4]；板藍(lán)根對多種細(xì)菌作用都有很好的抑菌作用[5]。本文采用醇水雙提法[6]提取各單方有效成分，并根據(jù)君、臣、佐、使的中醫(yī)藥理論進(jìn)行不同配比組方，探討不同配比組方復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的體外抑菌和耐藥抑制作用，以期為進(jìn)一步探討其耐藥抑制作用機(jī)制并為開發(fā)新的對抗耐藥菌的藥物提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；PYX-250Z-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱；YXQ-IS-SII全自動高壓滅菌器；SW-CJ-1F凈化工作臺；電熱恒溫水浴鍋。

菌株：耐藥金黃色葡萄球菌（Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。中藥魚腥草、黃芩、連翹、金銀花和板藍(lán)根等，購自長沙養(yǎng)天和大藥房。

培養(yǎng)基：按照NCCLS規(guī)定[7]配制各種肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。藥敏紙片杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備 耐藥金黃色葡萄球菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板37℃培養(yǎng)24 h，挑選典型菌落接種于肉湯中，再經(jīng)37℃肉湯培養(yǎng)18 h后，將菌液稀釋至106CFU/mL備用。

1.2.2 復(fù)方魚腥草制劑的制備 采用醇水雙提法。取魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、連翹等5味中藥粉末過20目篩，分別采用醇水雙提法提取有效成分，濃縮至含生藥濃度為1 g/mL的制劑，滅菌后放置冰箱中備用。將各單方制劑按照一定的比例混合，得到3種不同配比的復(fù)方魚腥草制劑。

1.2.3 體外抑菌試驗(yàn)藥敏紙片法[7]取3個配比復(fù)方魚腥草制劑各適量，放入直徑為6mm的滅菌濾紙片浸泡2 h，浸泡2次。待其自然涼干后，用紫外線照射滅菌15min。吸取0.1mL菌液于滅菌平皿內(nèi)，用玻棒鋪勻，然后貼上含有藥液的紙片，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，取平均值，以此判定藥物抑菌效果。

1.2.4 最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用二倍稀釋法測定[8]，相同過程重復(fù)操作3次。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測定 取MIC測定的前4～6管進(jìn)行涂板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長，平皿培養(yǎng)基中計數(shù)少于5個菌落者作為該藥物的最低殺菌濃度（MBC）。

1.2.6 平板挖孔法[9]將耐藥金黃色葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，經(jīng)稀釋后取0.1mL涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上，用打孔器挖出直徑約6mm的孔，2孔間距約20mm，然后將0.05mL復(fù)方魚腥草制劑加入瓊脂孔內(nèi)，并在相鄰孔內(nèi)加入一定量用于檢測藥物敏感性的諾氟沙星，培養(yǎng)18 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.7 耐藥抑制藥敏紙片法[10-11]對照組：將在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌稀釋后吸取0.1mL涂抹于瓊脂培養(yǎng)皿上。試驗(yàn)組：將金黃色葡萄球菌在含有抑菌濃度復(fù)方魚腥草制劑的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，稀釋后吸取0.1mL涂抹瓊脂培養(yǎng)皿上，然后相對應(yīng)貼上諾氟沙星藥敏紙片，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果[7]。

2 結(jié)果

2.1 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌圈測定結(jié)果 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌不同菌株的抑菌圈直徑測定結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，3個不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，且對Sa2抑菌作用最佳。

表1 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑測定結(jié)果 （mm）

2.2 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果 復(fù)方魚腥草制劑不同配比制劑對耐藥金黃色葡萄球菌不同菌株的最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果見表2、表3和表4。結(jié)果表明，復(fù)方魚腥草制劑配比2對耐藥金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳，Sa2耐藥株對各種配比的復(fù)方魚腥草制劑最敏感。

2.3 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度（MBC）測定結(jié)果 取MIC前4～6管進(jìn)行涂板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，3個配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌不同菌株的殺菌濃度見表5。

表2 復(fù)方魚腥草制劑配比1對5種耐藥金黃色葡萄球菌的M IC測定結(jié)果 （mg/mL）

表3 復(fù)方魚腥草制劑配比2對5種耐藥金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果 （mg/mL）

表4 復(fù)方魚腥草制劑配比3對5種耐藥金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果 （mg/mL）

2.4 復(fù)方魚腥草提取液耐藥抑制試驗(yàn)

2.4.1 平板挖孔法試驗(yàn)結(jié)果 平板挖孔法部分試驗(yàn)結(jié)果見圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5抗菌藥孔和中藥孔中間均未長菌，說明復(fù)方魚腥草提取液的3個配比對耐藥性金黃色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5均有一定的耐藥抑制作用，且對Sa2和Sa5的效果最為明顯。

表5 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對5種耐藥性金黃色葡萄球菌的MBC測定結(jié)果（mg/mL）

2.4.2 藥敏紙片法試驗(yàn)結(jié)果 耐藥抑制藥敏紙片法抑菌圈直徑測定結(jié)果見表6。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)過復(fù)方魚腥草提取液處理的耐藥性金黃色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5對諾氟沙星的敏感程度都有增加，其中對Sa2、Sa5的耐藥抑制效果十分明顯。

圖1 Sa2、Sa5平板挖孔法試驗(yàn)結(jié)果

表6 耐藥抑制藥敏紙片法抑菌圈直徑測定結(jié)果 （/mm）

3 討論

3.1 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4和Sa5的效果以配比2最佳。同一配比復(fù)方魚腥草制劑對不同菌株的抑菌效果不同，但3個配比復(fù)方魚腥草制劑均表現(xiàn)出對Sa2抑菌作用最強(qiáng)。可能是不同耐藥金黃色葡萄球菌對復(fù)方魚腥草制劑中五味中藥的敏感性不同，導(dǎo)致了不同比例組成的制劑抑菌效果有差異。

3.2 不同配比復(fù)方魚腥草制劑對耐藥金黃色葡萄球菌的耐藥抑制效果 平板挖孔法試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)是：中藥孔與抗菌藥孔周圍細(xì)菌生長，但兩孔間出現(xiàn)細(xì)菌不生長區(qū)域，視為耐藥抑制有效；兩孔周圍及孔間細(xì)菌均勻生長成片狀，視為中藥提取液對細(xì)菌耐藥性無抑制作用[10-11]。平板挖孔法是中西藥物聯(lián)合使用，從而可直觀地得出中西藥物的藥效協(xié)同作用；藥敏紙片法通過抑菌環(huán)大小可直接體現(xiàn)耐藥性變化情況。平板挖孔法和藥敏紙片法的試驗(yàn)結(jié)果一致表明，復(fù)方魚腥草提取液的3個配比對耐藥性金黃色葡萄球菌Sa1、Sa2、Sa3、Sa4、Sa5均有一定的耐藥抑制作用，但其中以配比2作用最強(qiáng)，且對Sa2和Sa5的效果最為明顯，對Sa3和Sa4的作用不明顯。

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