譚力凱，張民澤，邵振文，曹 楠，粟 碩，陳濟(jì)鐺，周 晗，張桂紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

A型流感病毒是能夠感染禽類、豬、馬、犬類、水生哺乳動(dòng)物及人類等宿主的重要病原體[1-2]。至今為止，已在A型流感病毒的自然宿主上分離出17種血凝素抗原(HA)和10種神經(jīng)氨酸酶抗原(NA)，除H17N10外的病毒亞型均已從禽類宿主中分離到[1-3]。此外，從其他宿主中分離到的流感病毒也常常來源于禽流感的跨宿主傳播[1]。1997年在香港暴發(fā)的H5N1禽流感導(dǎo)致了18名病患死亡，警示了我們關(guān)于禽流感跨宿主傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。

H6亞型流感病毒于1965年首次在火雞中分離，時(shí)至今日，H6亞型流感病毒已經(jīng)成為了分離頻率最高的禽流感病毒之一[5-8]。在華南地區(qū)，H6亞型流感病毒是在番鴨中最為普遍的流感病毒[9-10]。值得注意的是，養(yǎng)禽業(yè)中的H6亞型流感病毒有可能已經(jīng)獲得了偶發(fā)性跨宿主傳播感染哺乳動(dòng)物的能力。根據(jù)在中國(guó)和美國(guó)進(jìn)行的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，H6亞型禽流感病毒或許已經(jīng)感染過人類[11-12]。2010年在中國(guó)華南地區(qū)分離到的類禽型豬流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）是世界上首例從哺乳動(dòng)物上分離到H6亞型流感病毒的報(bào)道，其8個(gè)片段全部來源于水禽源H6亞型禽流感病毒[9-13]。為了更好地防控流感病毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生方面的威脅，對(duì)其傳播機(jī)理和致病機(jī)理進(jìn)行研究顯得尤為重要。

反向遺傳技術(shù)的出現(xiàn)使得從分子水平研究流感病毒致病性、種間傳播能力、病毒變異機(jī)制更為方便與直觀[14-15]。本試驗(yàn)利用反向遺傳操作技術(shù)首次建立了禽源H6亞型豬流感病毒8質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究該病毒的基因功能、致病機(jī)理和傳播機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株和主要試驗(yàn)材料 豬流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）（簡(jiǎn)稱GDK6）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存[13]；反向遺傳雙向表達(dá)載體pHW2000由密西西比州立大學(xué)萬秀峰助理教授饋贈(zèng)；感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH-5α由本實(shí)驗(yàn)室自行制備；293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自行保存；9日齡SPF雞胚由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；6周齡Balb/C小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 病毒RNA抽提試劑盒，購(gòu)自上海華舜生物公司；反轉(zhuǎn)錄酶MLV、RNA酶抑制劑（Ribo?nuclease Inhibitorv）、dNTPMixture（2.5and 10 mmoleach）、DNAMarker DL-2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；高保真酶PfuUltraⅡFusion Hs DNA Polymerase，購(gòu)自Agilent公司；限制性內(nèi)切酶Aar I、Bsa I、BsmB I及T4連接酶，均購(gòu)自Thermo Scientific公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?LTX，購(gòu)自Life Technologies公司；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，購(gòu)自Promega公司；中量質(zhì)粒抽提試劑盒，購(gòu)自Qiagen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 反轉(zhuǎn)錄(RT)通用引物為Uni-12（5'-AGCRAAAGCAGG-3'），根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]與GDK6病毒序列設(shè)計(jì)流感病毒基因組Segment1～8的PCR引物，由Life Technologies公司合成。

1.4 病毒RNA抽提及片段擴(kuò)增 根據(jù)病毒RNA抽提試劑盒說明書從分離保存的雞胚尿囊液中抽提病毒RNA，使用MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA；以cDNA為模板使用PfuUltraⅡFusion Hs DNA Polymerase對(duì)流感病毒的8個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后使用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR純化回收產(chǎn)物使用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，純化后將DNA片段克隆至經(jīng)酶切的pHW2000載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞后挑單菌落送至Life Technologies公司測(cè)序，測(cè)序正確的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒拯救 按照Lipofectamine?LTX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將8個(gè)重組質(zhì)粒按每個(gè)0.25μg的比例與6μL轉(zhuǎn)染試劑混合于300μL的opti-MEM培養(yǎng)基中，作用30min后共轉(zhuǎn)染于6孔板中293T細(xì)胞形成的90%細(xì)胞單層中。轉(zhuǎn)染后2 h往培養(yǎng)液中加入終濃度為1μg/mL的TPCK胰酶（Sigma公司）。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清并接種于MDCK細(xì)胞上，培養(yǎng)液中加入0.5%BSA（Sigma公司）和終濃度為1μg/mL的TPCK胰酶，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液并測(cè)定其血凝效價(jià)（HA）。拯救病毒簡(jiǎn)稱為rGDK6。

1.7 救獲病毒的鑒定 將救獲病毒進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)（HI）以確定其HA亞型；將救獲毒株在SPF雞胚上連續(xù)傳代3代后使用病毒RNA抽提試劑盒抽提救獲病毒RNA，使用MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增病毒M片段中較保守的一段，送Life Technologies公司測(cè)序，與親本毒株相應(yīng)序列比較序列結(jié)果。

1.8 救獲病毒與親本病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）比較 GDK6與rGDK6病毒分別以1∶103～1∶1010的8個(gè)稀釋度接種于MDCK細(xì)胞上進(jìn)行TCID50試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù)，以世界衛(wèi)生組織的規(guī)定計(jì)算TCID50。

1.9 救獲病毒與親本病毒對(duì)小鼠致病性比較

將GDK6與rGDK6病毒分別以106TCID50經(jīng)鼻腔途徑接種6周齡Balb/C小鼠，每組8只，連續(xù)觀察2周，每天記錄體重變化情況，攻毒后72 h隨機(jī)安樂死3只小鼠，取心、腦、脾、肺、腎接種9日齡SPF雞胚，72 h后通過HA試驗(yàn)檢測(cè)病毒。

2 結(jié)果

2.1 病毒基因組各片段擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

從分離保存的雞胚尿囊液中提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后分別用8對(duì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增流感病毒的8個(gè)基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到的HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2這8個(gè)基因片段與理論值相符。擴(kuò)增結(jié)果如圖1。將PCR產(chǎn)物純化回收后用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物連接至pHW2000載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH-5α中，挑單克隆菌株進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 GDK6株基因組各片段的RT-PCR擴(kuò)增

2.2 救獲病毒的鑒定 將轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞上清接種于MDCK細(xì)胞上，48 h后收集細(xì)胞上清，經(jīng)HA試驗(yàn)鑒定有血凝，經(jīng)HI試驗(yàn)鑒定為H6亞型，與親本毒抗原性一致。提取病毒RNA進(jìn)行RTPCR后。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明救獲病毒核酸序列與親本病毒相應(yīng)序列完全一致。將救獲病毒命名為rGDK6。

2.3 救獲病毒與親本病毒生物學(xué)特性比較 根據(jù)Reed-Muench法算得rGDK6毒株的TCID50為106.88/mL，與GDK6毒株相一致。

2.4 救獲病毒與親本病毒對(duì)小鼠致病性比較

rGDK6毒株與GDK6毒株以106TCID50劑量感染Balb/C小鼠后小鼠體重都有輕微下降，而對(duì)照組體重則持續(xù)上升（圖2）。感染后48 h可觀察到小鼠被毛豎立，食欲與精神狀態(tài)均正常。對(duì)小鼠各臟器進(jìn)行病毒檢測(cè)結(jié)果表明，rGDK6毒株與GDK6毒株均只能感染肺組織，在其他臟器里均檢測(cè)不到病毒。由此可見，救獲病毒與親本病毒對(duì)小鼠的致病性及組織嗜性基本一致。

圖2 病毒感染后的小鼠體重變化

3 討論

豬既能感染禽流感，也能感染人流感，因而是流感病毒重要的中間宿主，被稱為流感病毒的“生物混合器”。禽流感病毒感染豬后既有可能與人流感病毒發(fā)生基因重組產(chǎn)生新的易感染人類的毒株，也有可能通過在豬群間傳播從而產(chǎn)生適應(yīng)哺乳動(dòng)物的毒株[17]。因而對(duì)禽源豬流感病毒進(jìn)行致病機(jī)理和傳播機(jī)理的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本研究中采用的GDK6毒株是8個(gè)片段全部源于水禽源禽流感的豬流感病毒，是世界上首例H6亞型流感病毒感染哺乳動(dòng)物的報(bào)道。GDK6毒株的HA基因?qū)儆贕roup II譜系，該譜系的病毒至今仍在中國(guó)華南地區(qū)的水禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛傳播，是華南地區(qū)水禽養(yǎng)殖業(yè)中流感病毒的優(yōu)勢(shì)流行株[9-13]。因此需要進(jìn)一步對(duì)該病毒進(jìn)行研究其有無在哺乳動(dòng)物間傳播及對(duì)哺乳動(dòng)物致病的能力。

至今為止，關(guān)于H6亞型流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)和禽源豬流感的反向遺傳系統(tǒng)均少有報(bào)道，本研究建立起了GDK6毒株的反向遺傳系統(tǒng)，并成功拯救出了病毒。通過HI試驗(yàn)、病毒基因組測(cè)序、TCID50試驗(yàn)和小鼠攻毒試驗(yàn)表明，救獲毒株的生物學(xué)特性和對(duì)小鼠的致病性與親本病毒一致。目前，關(guān)于該病毒的傳播機(jī)理和對(duì)哺乳動(dòng)物的致病機(jī)理的研究依然處于空白，H6亞型流感病毒能否通過與其他亞型病毒基因重組或通過基因突變而產(chǎn)生能在哺乳動(dòng)物中造成流行的毒株依然未知。GDK6反向遺傳系統(tǒng)的建立為以后的研究開拓了道路，利用該系統(tǒng)可深入研究H6亞型流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病能力和傳播能力的關(guān)鍵基因及位點(diǎn)，探索其復(fù)制調(diào)控機(jī)制、變異方向、致病性、種間傳播分子機(jī)制，為預(yù)測(cè)流感病毒大流行提供依據(jù)，也為新型流感基因工程疫苗的研發(fā)提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

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