帥學宏，胡庭俊，曾 蕓，黃 明，馮世文，賴勝基

（1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶 榮昌402460；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧530005）

豬大腸桿菌病是由豬致病性大腸桿菌引起的一種急性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經濟損失。蟾酥是中國傳統(tǒng)的中藥，具有多種藥效，尤其在抗腫瘤方面的研究報道較多[1-2]。但關于其抗菌方面的研究報道較少。本試驗通過對仔豬預先注射蟾酥注射液，然后采用致病性大腸桿菌進行攻毒，觀察受試豬的腹瀉情況，并且測定豬外周血T淋巴細胞亞群變化，從而評價蟾酥注射液是否對仔豬致病性大腸桿菌感染具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品試劑 蟾酥注射液（廣西北斗星動物保健品有限公司，批號∶20110101）；穿心蓮注射液（廣西北斗星動物保健品有限公司，批號∶20091102）；大腸桿菌（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，型號∶C83901）；普通營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂（北京陸橋生物技術有限責任公司，批號分別為20100305和20100501）。

1.1.2 試驗動物 14～21日齡杜長大三元雜交仔豬，公母兼?zhèn)?，體重相近、臨床健康。

1.2 方法

1.2.1 蟾酥注射液對仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護試驗 將60頭仔豬隨機分為6組，每組10頭，分組及處理如下：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（為高、中、低劑量組）：分別按體重0.2mL/kg，0.1mL/kg，0.05mL/kg的劑量肌肉注射蟾酥注射液，1次/d，連用3 d；Ⅳ（藥物對照組）：按0.2mL/kg體重肌肉注射穿心蓮注射，1次/d，連用3d；Ⅴ（感染不給藥組）：按0.2mL/kg體重肌肉注射生理鹽水，1次/d，連用3 d，以上5組的仔豬于第4天分別肌肉注射4.0mL大腸桿菌液（3×109CFU/mL）；Ⅵ（空白對照組）：不給藥，不攻毒。自攻毒后，觀察發(fā)病頭數(shù)，腹瀉情況，從發(fā)病仔豬糞便中采樣分離細菌培養(yǎng)鑒定，連續(xù)14 d，試驗前后對受試豬稱重。

1.2.2 T淋巴細胞標記試驗 分別在給藥前、攻毒前及攻毒后第4天，前腔靜脈無菌采血，新鮮血液涂片，冷風立即吹干，冷丙酮-甲醛固定，37℃孵育2 h，孔雀石綠復染10 s，光鏡下觀察記數(shù)，T淋巴細胞內有棕黃色顆粒。T淋巴細胞陽性率=T淋巴細胞數(shù)/200個白細胞數(shù)。

1.2.3 外周血T淋巴細胞亞群的測定 分別在給藥前、攻毒前及攻毒后第4天，前腔靜脈無菌采血，抗豬淋巴細胞CD4+（7421224，LgG2b）單克隆抗體，為FTTC標記；抗豬淋巴細胞CD8+（7622211，LgG2a）單克隆抗體，為Biotin標記。EPICS2XL流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群。

1.2.4 統(tǒng)計分析 用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析。

2 試驗結果

2.1 蟾酥注射液對仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護作用 攻毒后，從發(fā)病豬腸內容物分離細菌后經生化鑒定有該大腸桿菌存在。蟾酥注射液不同劑量組、藥物對照組的保護率與感染不給藥組比較差異均極顯著（P＜0.01）。高、中劑量組與低劑量組比較差異顯著（P＜0.05），藥物對照組與低劑量組差異不顯著（P＞0.05）。增重方面，3種蟾酥注射液劑量組、藥物對照組與感染不給藥對照組比較差異均極顯著（P＜0.01）；藥物對照組與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）；高、中劑量組與低劑量組比較差異顯著（P＜0.05）。見表1。

表1 蟾酥注射液對仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護作用試驗

2.2 T淋巴細胞標記測定結果 攻毒前，蟾酥注射液不同劑量組及穿心蓮注射液藥物對照組的T淋巴細胞陽性率與給藥前比較均有升高，感染不給藥組及空白對照組上升不明顯。攻毒后第4天，蟾酥注射液不同劑量組的T淋巴細胞陽性率與接種細菌前比較還有小幅度升高，感染不給藥組有較大幅度的降低，穿心蓮注射液藥物對照組及空白對照組有下降趨勢。見表2。

表2 蟾酥注射液對仔豬T淋巴細胞標記試驗

2.3 外周血T淋巴細胞亞群的測定結果 與感染不給藥組相比，高、中劑量蟾酥注射液在首次用藥后第4天均能顯著升高豬外周血CD4+細胞所占百分比（P＜0.05）。攻毒后第4天，感染不給藥組豬外周血CD4+細胞所占百分比與陰性對照組相比顯著下降（P＜0.05）；蟾酥注射液高、中、低劑量組豬外周血CD4+細胞所占百分比仍維持在較高水平，與感染不給藥組相比較差異極顯著（P＜0.01）。藥物對照組豬外周血CD4+細胞所占百分比在攻毒后第4天與感染不給藥組相比差異顯著（P＜0.05）。見表3。

3 討論

仔豬大腸桿菌性腹瀉是由致病性大腸桿菌引起的一類仔豬腸道傳染性疾病，是仔豬的一種常見病和多發(fā)病。該病已逐漸成為影響?zhàn)B豬業(yè)健康快速發(fā)展的重要因素之一。此病主要危害2～3周齡仔豬，臨床特征是排出灰白色的漿糊樣稀便，黏膩腥臭，排便次數(shù)不等。病豬消瘦，發(fā)育遲緩。本試驗將大腸桿菌按3×109CFU/mL×4mL/頭的劑量給仔豬攻毒，成功的誘導仔豬產生腹瀉。

表3 蟾酥注射液對豬外周血CD4+和CD8+細胞所占百分比的影響 （Mean±SD,n=5,單位：%）

蟾酥藥理活性強，具有抗腫瘤、強心、升壓、興奮呼吸、增強免疫力等作用[3]。蟾酥能提高小鼠免疫功能，增強小鼠脾臟溶血空斑形成細胞活性，促進巨噬細胞吞噬功能以及增高血清溶菌酶滴度等[4]。蟾酥增強機體免疫功能在醫(yī)學上已被證實，在動物體上也有研究[5]。有報道蟾酥對活體家兔體內大腸桿菌抑制作用[6]。本試驗中，對仔豬預先注射了不同劑量的蟾酥注射液后，再用大腸桿菌攻毒，仔豬的腹瀉率顯著降低，并且蟾酥注射液劑量越高，保護的效果越好，低劑量組效果較差，可能是由于用藥劑量不足。說明蟾酥注射液對此日齡段仔豬由大腸桿菌引起的腹瀉有一定的保護功能，可提高仔豬的抗病力。

T淋巴細胞在胸腺內發(fā)育后移行至外周淋巴組織，與某種特異性抗原或細胞相互接觸時，發(fā)揮免疫功能，在機體的細胞免疫和體液免疫誘導中均有重要作用[7]。T淋巴細胞陽性率反映T淋巴細胞數(shù)量的變化，很好反映機體細胞免疫機能的高低和評價抗病力的強弱[8]。連用3 d蟾酥注射液后可提高T淋巴細胞陽性率，攻毒后第4天不同劑量蟾酥注射液組的T淋巴細胞陽性率與攻毒前比較有小幅度升高，感染不給藥組則有較大幅度的降低。結果表明，蟾酥注射液對仔豬T淋巴細胞的增殖有顯著的促進作用。

T淋巴細胞表面抗原CD4+、CD8+分別是輔助性T細胞及殺傷性T細胞的表面特異性標志。CD4+淋巴細胞通過分泌細胞因子來調節(jié)機體免疫功能，具有輔助T淋巴細胞轉變?yōu)樾毎?，輔助B淋巴細胞生成抗體等作用，起到誘導和輔助細胞和體液免疫的作用，稱為輔助T細胞[9]。本試驗結果表明，蟾酥注射液可顯著刺激豬CD4+細胞的增殖，增強豬的非特異性免疫功能，尤其是細胞免疫功能，使機體處于保護性免疫應答狀態(tài)，從而對豬致病性大腸桿菌感染具有保護作用。

4 結論

適當劑量的蟾酥注射液對人工感染豬致病性大腸桿菌具有保護作用，能增強豬的細胞免疫功能，臨床上可用于預防仔豬大腸桿菌感染，推薦劑量為0.1mL/kg體重，肌肉注射，1次/d，連用3 d。

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