張啟迪，張 慧，鄒 明，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島266109）

白頭翁湯為清熱解毒、涼血止痢的中藥湯劑，始出于張仲景的《傷寒論》。該方由白頭翁15 g、黃連6 g、黃柏12 g、秦皮12 g 4味藥組成。其中，白頭翁為毛莨科多年生草本植物白頭翁的干燥根，具有清熱解毒，涼血止痢之功效，為白頭翁口服液中的君藥。黃連苦寒，瀉火解燥濕厚腸，為治痢要藥；黃柏清下焦?jié)駸幔?藥共助君藥清熱解毒，尤能燥濕治痢，共為臣藥[1]。秦皮為木犀科白蠟樹植物的干燥樹皮，味苦，性寒，用于熱痢泄瀉，目生翳膜等[2]，為白頭翁口服液中的佐藥。該方證原為治濕熱痢疾的首選方劑[3]。近年來(lái)隨著研究者對(duì)白頭翁湯的深入研究，在獸醫(yī)臨床上也逐漸廣泛應(yīng)用。肖琛聞等[4]曾采用白頭翁湯治療鴨疫里默氏菌病，結(jié)果該方能改善癥狀并減少死亡率。祝國(guó)強(qiáng)等[5]試驗(yàn)證明，白頭翁湯對(duì)沙門菌接種的雞胚有較好的保護(hù)作用。

隨著該藥的廣泛生產(chǎn)使用，進(jìn)一步充分提取藥物有效成分、優(yōu)化鑒別方法成為研究熱點(diǎn)。本文旨在通過單煎、兩兩合煎和全方合煎來(lái)比較不同配伍對(duì)沉淀量產(chǎn)生的影響來(lái)優(yōu)化煎煮方法，通過不同提取次數(shù)得到的出膏率篩選最佳提取工藝，對(duì)各藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別時(shí)改變氨水添加順序，以優(yōu)化藥物薄層鑒別方法，進(jìn)一步推動(dòng)白頭翁湯在臨床上的應(yīng)用，來(lái)更好地適應(yīng)市場(chǎng)的需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥材與試劑 黃連對(duì)照藥材（批號(hào)：Z00107 04）、秦皮對(duì)照藥材（批號(hào)：Z0070607）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：Z0220712）、白頭翁皂苷B4對(duì)照品（批號(hào)：111766-200601），均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；藥材白頭翁、黃柏、黃連和秦皮，均購(gòu)自安徽廣印堂制藥有限公司；乙醇、甲醇、苯、甲苯、甲酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、正丁醇、濃氨水、濃硫酸等均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 CB10-UV6E1型多功能暗箱式紫外分析儀（北京賽百奧科技有限公司）；GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；DS-671型電子稱（上海金山亭林工業(yè)開發(fā)區(qū)）；HC-3018型普通高速離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司）；5.0μL微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）；KMD型控溫電熱套（鄄城華魯電熱儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備 藥材預(yù)處理：將秦皮、黃連、黃柏3種藥材分割成長(zhǎng)約0.5 cm左右的塊段，保證干燥，稱量備用；容器編號(hào)；清洗濾布；將硅膠G板分割成長(zhǎng)寬為10×5 cm的小板；校正pH計(jì)；儀器的清洗烘干等。

1.2.2 提取次數(shù)對(duì)出膏率的影響 按處方量稱取藥物，加8倍量水浸泡30min，煎煮，每次0.5 h，提取次數(shù)分別設(shè)定為2次、3次和4次。4層紗布過濾提取液，合并濾液，冷卻后于4℃冰箱過夜，過濾，濃縮至約60mL后倒入墊有錫紙的托盤，105℃烘箱烘至恒重，稱量干膏重量并計(jì)算出膏率（出膏率=干膏重量/全方藥物干重×100%）。

1.2.3 藥材配伍對(duì)沉淀量的影響

1.2.3.1 單味藥水煎 遵照處方中藥物含量稱取各藥材，每種藥各加入8倍量水，浸泡30min后均煎煮3次，每次0.5 h，水提液濾過后合并，濃縮至25mL，冷卻至室溫，搖勻后取10mL加入刻度離心管，離心5min（4 000 r/min），觀察計(jì)算各藥沉淀百分比（沉淀百分比=沉淀干重/藥材干重）。求和計(jì)算占取全方劑含量的沉淀百分比。

1.2.3.2 兩兩藥合煎 將4味藥按處方量?jī)蓛苫旌?，共搭?組，分別加入8倍量水，以下操作同上，計(jì)算兩兩藥沉淀百分比后，求取每組全方劑的沉淀比例，并對(duì)3組處方沉淀百分比求平均。

1.2.3.3 全方合煎 按處方量稱取藥物，加水360mL，浸泡30min后合煎水提3次，每次0.5 h，過濾，合并濾液，濃縮至45mL，搖勻后取10mL于刻度離心管，4 000 r/min離心5min，計(jì)算沉淀百分比。

1.2.4 氨水添加順序?qū)S連、秦皮薄層鑒別的影響

1.2.4.1 黃連鑒別（1）先氨水處理，后展開：取1.5 mL白頭翁湯，加10mL甲醇，搖勻，作為供試品溶液。取0.2 g黃連對(duì)照藥材，加10mL甲醇，加熱回流15min，過濾，濾液作為對(duì)照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品2.5mg，加5mL甲醇，作為對(duì)照品溶液。吸取以上3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，先用濃氨水飽和蒸氣處理，后以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1）為展開劑展開，取出，晾干，檢視（365 nm紫外光燈下）。

（2）氨水與展開劑同置：吸取以上3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，將濃氨水和展開劑同置，展開，取出，晾干，同樣條件下檢視。

（3）先展開，后氨水處理：吸取以上3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開劑展開后，用濃氨水處理，取出，晾干，同樣條件下檢視。

（4）未使用氨水：吸取以上3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開劑展開，取出，晾干，同樣條件下檢視。

1.2.4.2 秦皮鑒別 （1）先用氨水，后展開：取3.5 mL白頭翁湯，加10mL乙醇，搖勻，作為供試品溶液。取秦皮對(duì)照藥材1 g，加10mL乙醇，加熱回流10min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。吸取以上兩種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，先用濃氨水飽和蒸氣處理，再以正丁醇-三氯甲烷-甲苯-甲酸（8∶1∶1∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

（2）氨水與展開劑同置：方法同2.4.1.2。

（3）先展開，后用氨水：方法同2.4.1.3。

（4）未使用氨水：方法同2.4.1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取次數(shù)對(duì)出膏率的影響 不同提取次數(shù)下所得的出膏率值，結(jié)果見表1。

表1 提取次數(shù)對(duì)得膏率的影響

通過稱量、計(jì)算，得出提取次數(shù)為4次時(shí)出膏率最高為29.47%。

2.2 藥材配伍對(duì)沉淀量的影響

2.2.1 單味藥水提取沉淀量結(jié)果 結(jié)果見表2。

經(jīng)稱量計(jì)算單味藥水提所得沉淀量占全方劑的百分比為12%。

2.2.2 兩兩藥合煎沉淀量結(jié)果 結(jié)果見表3。

經(jīng)過稱量計(jì)算，三組兩兩合煎的全方劑沉淀百分比分別為9%、7.5%、8.5%，對(duì)其求平均，最終沉淀百分比為8.3%。

表2 單味藥水煎沉淀量比較

表3 兩兩藥合煎沉淀量比較

2.2.3 全方合煎沉淀量結(jié)果 經(jīng)過稱量計(jì)算，全方煎煮產(chǎn)生的沉淀量百分比為6%。

2.3 氨水添加順序?qū)S連、秦皮鑒別的影響結(jié)果總結(jié)如表4。

3 結(jié)論

3.1 提取次數(shù)對(duì)出膏率的影響 不同提取次數(shù)對(duì)出膏率有一定影響，本試驗(yàn)最佳提取次數(shù)為4次，出膏率最高為29.47%。

3.2 藥材配伍對(duì)沉淀量的影響 藥材配伍不同，沉淀量大小有所差異。結(jié)果顯示，藥物兩兩合煎沉淀量較各藥單煎沉淀量少，而全方煎煮產(chǎn)生的沉淀百分比最少，且操作簡(jiǎn)單。

表4 氨水添加順序?qū)S連、秦皮鑒別的影響

3.3 氨水添加順序?qū)S連、秦皮鑒別的影響結(jié)果 氨水添加順序?qū)λ幏街星仄?、黃連的薄層鑒別有不同影響。濃氨水預(yù)飽后展開的黃連薄層鑒別效果更好，而秦皮的鑒別則不需經(jīng)過濃氨水的處理。

4 討論

4.1 提取工藝的優(yōu)化 該試驗(yàn)中通過表4，提取4次出膏率最高為29.47%，提取2次出膏率最低21.90%，得到出膏率與提取次數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，為白頭翁湯的臨床應(yīng)用提供了可靠的依據(jù)。

據(jù)相關(guān)研究表明，白頭翁湯劑在煎煮過程中會(huì)產(chǎn)生大量的沉淀[6]。不同的煎煮方法產(chǎn)生的沉淀量不同，本試驗(yàn)結(jié)果為白頭翁湯全方合煎沉淀比例最少，兩兩合煎次之，單味藥的煎煮沉淀比例最多。由此可推出，白頭翁湯的提取應(yīng)選擇全方合煎提取，這樣大大地提高了白頭翁湯的臨床藥效物質(zhì)成分的含量。并推測(cè)白頭翁湯各原料藥材在合煎時(shí)可能有增加溶解度的作用，這與時(shí)維靜等[7]在白頭翁湯提取工藝試驗(yàn)研究中的結(jié)論相同。

4.2 薄層鑒別方法的優(yōu)化 參考2010年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》，對(duì)于白頭翁湯中藥材的鑒別方法進(jìn)行研究。由表4結(jié)果可知，通過改變氨水添加順序來(lái)研究其對(duì)秦皮、黃連鑒別的影響，得出濃氨水與展開劑同置使黃連的鑒別效果最好，而秦皮的鑒別則不需經(jīng)過濃氨水的處理，這與侯麗麗等[8]等研制結(jié)果相符。尤其指出，對(duì)于秦皮的鑒別，濃氨水不可與展開劑同置，否則會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶，造成檢測(cè)成分無(wú)法展開。

本試驗(yàn)在提取工藝上只對(duì)提取方法和提取次數(shù)兩個(gè)因素進(jìn)行了考察，對(duì)于整個(gè)制備工藝來(lái)說尚有更多影響因素有待考察。而對(duì)影響白頭翁湯中黃連、秦皮的薄層色譜鑒別條件的研究，是在確保鑒別的專一性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，使目標(biāo)成分可以得到有效分離，斑點(diǎn)清晰，背景幾乎無(wú)干擾，進(jìn)而使檢驗(yàn)方法得以優(yōu)化，為今后白頭翁湯的鑒別提供理論依據(jù)。

[1]曲龍妹，趙春杰，李丹，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選白頭翁湯提取工藝[J].中國(guó)藥房，2009，20（12）：904-906.

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（第六卷）[M].上海：上海科學(xué)出版社，1998：163-167.

[3]孫俊穎，彭新宇，魏光偉，等.白頭翁湯的藥理作用研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（12）：112-113.

[4]肖琛聞，鮑國(guó)連，韋強(qiáng)，等.中藥方劑對(duì)鴨疫里氏桿菌病的治療效果研究[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2010（1）：6-9.

[5]祝國(guó)強(qiáng)，侯鳳琴，鐘翠紅，等.白頭翁湯抑制感染雞胚死亡和防治肉雞白痢的試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（3）：84-85.

[6] 朱華旭，丁林生.白頭翁湯沉淀化學(xué)成分研究[J].中成藥，2002，24（4）：293-296.

[7]時(shí)維靜，崔全民，李立順.白頭翁湯提取工藝試驗(yàn)研究[J].中國(guó)試驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12（5）：1-3.

[8]侯麗麗，柴桂珍，馬澤寧.關(guān)于白頭翁散中秦皮薄層鑒別方法的探討[J].中國(guó)獸藥雜志，2008，42（2）：52-53.