夏耘

銀屑病患者外周血白細(xì)胞膜CD14及血漿可溶性CD14表達(dá)的臨床意義分析

夏耘①

目的：探討銀屑病（PSG）患者外周血白細(xì)胞膜CD14及血漿可溶性CD14表達(dá)的臨床意義分析。方法：選擇36例尋常性PSG患者（PSG組）和52例健康體檢者（健康對照組），觀察和比較兩組外周血白細(xì)胞mCD14及sCD14表達(dá)水平。結(jié)果：PSG組患者外周血白細(xì)胞膜聯(lián)mCDl4的表達(dá)水平為（6.20±2.20）%，其中進(jìn)行期、靜止期分別為（7.30±2.40）%、（4.70±2.20）%，均較健康對照組明顯增高（P＜0.01）。PSG組患者外周血白細(xì)胞膜sCD14的濃度平均為（1.39±0.38）μg/mL，其中進(jìn)行期、靜止期分別為（1.42±0.39）μg/mL、（1.21±0.44）μg/mL，均較健康對照組顯著增高（P＜0.01）。結(jié)論：外周血白細(xì)胞膜CD14及血漿可溶性CD14對銀屑病的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷等均有重要的意義。同時有助有于進(jìn)一步探討PSG發(fā)病機(jī)制。

外周血白細(xì)胞膜CD14； 血漿可溶性CD14； 銀屑??； 表達(dá)； 皮損

銀屑病（Parapsoriasis guttata，PSG）屬于一種多發(fā)性慢性炎癥性皮膚病，往往病程遷延，反復(fù)發(fā)作。病理研究發(fā)現(xiàn)，PSG是在多基因遺傳條件下T細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的免疫性疾病[1-2]。PSG發(fā)病機(jī)理與免疫力、細(xì)菌或病毒感染、遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)及精神狀態(tài)等關(guān)系密切。細(xì)菌感染是誘發(fā)PSG加重的一個重要因素。研究表明，革蘭陰性桿菌是導(dǎo)致部分慢性炎癥的主要致病菌，此類陰性桿菌長期大量生長及死亡，釋放、裂解出細(xì)胞壁脂多糖即內(nèi)毒素，能夠擴(kuò)張血管，增高中性粒細(xì)胞及血管通透性，并激活補(bǔ)體[3]。內(nèi)毒素組成主要是脂多糖，脂多糖與內(nèi)毒素受體膜聯(lián)CD14（mCD14）、Toll樣受體（TLR4）、MD-2等受體復(fù)合物相結(jié)合，可激活細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而激活核因子KB（NFKB），生成腫瘤壞死因子、IL-6、IL-8及干擾素γ等炎癥因子[4]。此類炎癥因子在PSG發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。因此，脂多糖及其信號通路在PSG發(fā)病過程扮演重要角色。本研究測定了PSG患者外周血白細(xì)胞mCD14及血漿中可溶性CD14 （soluble CD14，sCD14）的表達(dá)，以分析內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活與PSG的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年5月-2012年5月于本院門診診治的尋常性PSG患者36例（PSG組），均符合第3版《臨床皮膚病學(xué)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床癥狀典型。男22例，女14例，年齡23～53歲，平均（35.4±7.1）歲，病程7個月～18年，平均（2.7±1.1）年。以嚴(yán)重性指數(shù)（PASI）及PSG皮損面積對PSG患者病情狀態(tài)進(jìn)行評估[4]。其中，進(jìn)行期20例（55.6%），靜止期16例（44.4%）。入選患者最近1個月內(nèi)未接受過藥物如糖皮質(zhì)激素、抗生素、免疫抑制劑及光化學(xué)藥物系統(tǒng)療法，肝腎功能均正常；選擇同期在本院行常規(guī)健康體檢并檢查合格的志愿者（健康對照組）52例，男29例，女23例，年齡21～56歲，平均（36.1±8.4）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 外周血白細(xì)胞表面mCD14表達(dá)的檢測

1.2.1.1 兩組全血標(biāo)本的采集 兩組均采集3 mL靜脈血，以乙二胺四乙酸（EDTA）-K2為抗凝劑。

1.2.1.2 直接法免疫熒光標(biāo)記 按使用說明書及實(shí)際樣本量配制所需量的試劑。取100 μL EDTA抗凝的人外周靜脈血，添加20 μL的熒光抗體抗mCD14-APC，混和均勻，避光孵育30 min。添加2 mL紅細(xì)胞溶解液并混合均勻，室溫條件下孵育10 min，至孵育液完全澄清透明。1000 rpm離心5 min，棄上清，將細(xì)胞懸浮在約0.5 mL的4%多聚甲醛溶液中，振蕩混勻后以流式細(xì)胞儀（美國guava）進(jìn)行檢測。

1.2.1.3 使用同型對照熒光測定陰性范圍 完成各通道之間熒光補(bǔ)償值設(shè)置后，依次進(jìn)行標(biāo)本檢測，作CD14熒光的直方圖，應(yīng)用CellQuest軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 血漿中sCD14水平的檢測

1.2.2.1 血漿標(biāo)本采集 上述實(shí)驗(yàn)過程中剩下的EDTA抗凝血樣本，在2000 rpm條件下，離心8 min獲得血漿，保存于-80 ℃直至檢測。

1.2.2.2 ELISA檢測 取出酶標(biāo)板，每孔中加入100 μL的抗體稀釋液。之后添加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及對照品，混合均勻，每樣本作為2個復(fù)孔。室溫條件下孵育3 h后吸干孔中的液體，加入300 μL洗液洗滌，反復(fù)4次。每孔中添加200 μL的sCD14酶結(jié)合物，室溫條件下孵育l h。反復(fù)洗滌3次后，每個孔中添加200 μL的底物，室溫條件下孵育30 min。每孔加入50 μL的終止液，30 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上，于450 nm波長處讀取各孔吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果 PSG組患者外周血白細(xì)胞膜mCD14的表達(dá)水平平均為（6.20±2.20）%，其中進(jìn)行期、靜止期分別為（7.30±2.40）%、（4.70±2.20）%，均較健康對照組明顯增高 （P＜0.01）；且進(jìn)行期、靜止期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 ELISA法檢測結(jié)果 PSG組患者外周血白細(xì)胞膜sCD14的濃度平均為（1.39±0.38）μg/mL，其中進(jìn)行期、靜止期分別為（1.42±0.39）μg/mL、（1.21±0.44）μg/mL，均較健康對照組顯著增高 （P＜0.01）。見表1。

表1 銀屑病患者組與健康體檢對照組外周血白細(xì)胞mCD14及sCD14表達(dá)水平比較（±s）

表1 銀屑病患者組與健康體檢對照組外周血白細(xì)胞mCD14及sCD14表達(dá)水平比較（±s）

*與健康對照組比較，P＜0.01；△與靜止期比較，P＜0.05

組別 m C D 1 4表達(dá)（% ） s C D 1 4表達(dá)（μ g / m L ）P S G組（n = 3 6） 6 . 2 0 ± 2 . 2 0* 1 . 3 9 ± 0 . 3 8*進(jìn)行期（n = 2 0） 7 . 3 0 ± 2 . 4 0*△ 1 . 4 2 ± 0 . 3 9*靜止期（n = 1 6） 4 . 7 0 ± 2 . 2 0* 1 . 2 1 ± 0 . 4 4*健康對照組（n = 5 2） 3 . 5 7 ± 0 . 9 0 1 . 0 7 ± 0 . 3 2

3 討論

之前對細(xì)菌感染誘發(fā)PSG的研究多集中在革蘭陽性桿菌超抗原，如金黃色葡萄球菌腸毒素B、鏈球菌致熱性腸毒素A、中毒性休克蛋白-1等，此類革蘭陽性桿菌超抗原能夠激活T淋巴細(xì)胞，合成不同類型的炎癥因子，刺激角質(zhì)致使細(xì)胞增殖，而觸發(fā)PSG的發(fā)生[7]。臨床上，筆者經(jīng)常見到合并革蘭陰性桿菌感染誘發(fā)的各類慢性炎癥PSG患者病情遷延不愈或隨炎癥程度而加重的現(xiàn)象，腸道和膽道感染、萎縮性胃炎、泌尿生殖炎癥等。皮損程度往往隨病情的加重而加重，提示此類病灶可能與PSG發(fā)病關(guān)系密切。內(nèi)毒素是革蘭陰性桿菌的主要致病物質(zhì)，其成分主要為脂多糖[8]。脂多糖可產(chǎn)生多種強(qiáng)的生理學(xué)效應(yīng)，對宿主先天存在及環(huán)境適應(yīng)性免疫反應(yīng)均有顯著的影響。脂多糖內(nèi)毒素與細(xì)胞膜上的mCD14、Toll樣受體4（Toll-likereceptor 4，TLR4）等受體復(fù)合物相結(jié)合能啟動細(xì)胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終激活NF-KB，通過對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)合成大量的細(xì)胞因子，包括不同類型的黏附分子、前列腺素、趨化因子及一氧化氮等。不同類型的炎性因子如IL-6、IL-8、ICAM-1、腫瘤壞死因子α、一氧化氮、前列腺素2等均在PSG中高度高表達(dá)[9]。有研究報(bào)道，PSG患者可能有膽汁酸分泌上的缺陷，可將從腸道吸收內(nèi)毒素分解代謝為無毒性產(chǎn)物，以去氫膽酸治療PSG臨床療效較常規(guī)療法更好?？傊瑧岩蓛?nèi)毒素及其信號傳導(dǎo)通路很有可能在PSG發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[10]。

CD14是脂多糖LPS受體復(fù)合物重要成員，TLR4等一同介導(dǎo)LPS跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。CD14屬于單核或巨噬細(xì)胞表面的一種高度分化的抗原，屬于糖蛋白，它有兩種存在形式：mCD14及sCD14。mCD14主要存在于細(xì)胞膜上，而其表達(dá)則主要在單核/巨噬細(xì)胞等髓樣細(xì)胞表面，是單核/巨噬細(xì)胞高度分化的典型特征[12-13]。中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜表面也存在少量mCD14。sCD14主要存在于血清中，來源于髓樣細(xì)胞分泌或mCD14的脫落。人體內(nèi)CD14分子以sCD14為主要存在形式[14-15]。研究表明，LPS作用后的人外周靜脈血單核細(xì)胞mCD14的表達(dá)水平顯著增高；內(nèi)毒素血癥時患者外周血sCD14水平也較健康狀態(tài)時明顯上升，推測CD14的升高提示可能存在感染[16-17]。王瓊玉等[18]研究顯示，尋常性PSG患者血清及皮損吸皰液中sCD14濃度均較健康人明顯上升，經(jīng)治療后患者血清sCD14可降至正常。提示PSG患者單核細(xì)胞活性異常升高，并進(jìn)一步推測PSG患者可能出現(xiàn)血清內(nèi)毒素升高[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中，PSG組外周血白細(xì)胞膜mCD14的表達(dá)水平以及進(jìn)行期、靜止期水平均較健康對照組明顯增高（P＜0.01）；且進(jìn)行期高于靜止期 （P＜0.05）。銀屑病組患者外周血白細(xì)胞膜sCD14的平均濃度及進(jìn)行期、靜止期濃度均較健康對照組顯著增高（P＜0.01）。本結(jié)果與Schopf的相關(guān)結(jié)論一致，且流式細(xì)胞儀測定亦證實(shí)PSG患者外周血白細(xì)胞表面的mCD14表達(dá)量顯著上調(diào)，表明PSG患者血漿中內(nèi)毒素濃度很可能是異常增高的[21]。

總之，內(nèi)毒素及其信號傳導(dǎo)通路在PSG發(fā)病中起重要作用[22-23]。但對于各種內(nèi)毒素作用于T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的準(zhǔn)確機(jī)制，仍需深入的體內(nèi)、體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[24]。對此領(lǐng)域的進(jìn)一步研究將有助于進(jìn)一步探討PSG發(fā)病機(jī)制，并為銀屑病治療尋找新的方法[25]。

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The Analysis of the Clinical Significance of the Expression of CD14 and CD14 Levels in White Blood Cell of Patients with Psoriasis

/Xia Yun.//Medical Innovation of China，2014，11（08）：000-000

Objective：To explore the clinical significance of expression of psoriatic peripheral white blood cell membrane CD14 and plasma soluble CD14 in patients with psoriasis.Method：36 patients with PSG and 52 healthy subjects were collected， expression of psoriatic peripheral white blood cell membrane CD14 and plasma soluble CD14 of two groups were observed and compared.Result：The average expression levels of mCDl4 in white blood cell patients with psoriasis group was （6.20±2.20）%，in which the active phase and stationary phase were （7.30±2.40）%，（4.70±2.20）% respectively. They were significantly higher than the healthy control group and there was significant difference（P＜0.05）.The average concentration of sCD14 in white cell membrane of peripheral blood of psoriasis patients was（1.39±0.38）μg/mL，in which the active phase and stationary phase were （1.42±0.39）μg/mL，（1.21±0.44）μg/mL respectively. Comparing with healthy control group，the levels significantly increased with significant difference （P＜0.05）.Conclusion：Diagnostic significance of white blood cell of patients with psoriasis and CD14 plasma soluble CD14 on the pathogenesis of psoriasis diagnosis has important clinical diagnosis. At the same time， help to further explore the pathogenesis of PSG.

Peripheral white blood cell membrane CD14； Plasma soluble CD14； Psoriasis； Expression；Skin lesion

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.07.000

2013-08-13） （本文編輯：黃新珍）

①湖北省荊州市第一人民醫(yī)院 湖北 荊州 434000

夏耘

First-author’s address： The First People’s Hospital of J ingzhou City，J ingzhou 434000，China