董子龍武妍婷張生彬

多效生長(zhǎng)因子（PTN）mRNA及其蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

董子龍①武妍婷①?gòu)埳颌?/p>

目的：探討結(jié)直腸癌組織中多效生長(zhǎng)因子（PTN）mRNA及其蛋白的表達(dá)情況及臨床意義。方法：購(gòu)買(mǎi)結(jié)直腸癌組織芯片標(biāo)本90例（實(shí)驗(yàn)組），正常結(jié)直腸組織芯片70例（對(duì)照組），采用原位雜交和免疫組化染色方法，檢測(cè)兩組PTN mRNA及其蛋白的表達(dá)；另選擇2009年11月-2013年12月手術(shù)治療的原發(fā)結(jié)直腸癌患者90例，分析PTN mRNA及其蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組PTN mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為62.2%，PTN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為58.9%，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別及不同腫瘤類(lèi)型之間，PTN mRNA及其蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同TNM分期和不同分化程度，PTN mRNA及其蛋白陽(yáng)性表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：PTN mRNA及其蛋白與腫瘤分期和分化程度有密切關(guān)系，可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的參考依據(jù)。

多效生長(zhǎng)因子； PTN蛋白； 結(jié)直腸癌組織

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率，我國(guó)作為結(jié)直腸癌的高發(fā)國(guó)家，其發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[1-2]。PTN作為重要的生長(zhǎng)因子，具有多信號(hào)功能，能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、血管發(fā)生及刺激細(xì)胞增殖和遷移[3-4]。本文回顧性分析PTN在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，旨在為判斷預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 購(gòu)買(mǎi)由陜西超英生物科技有限公司生產(chǎn)的結(jié)直腸癌組織芯片標(biāo)本共90例（實(shí)驗(yàn)組），正常結(jié)直腸組織芯片70例（對(duì)照組）。另選擇2009年11月-2013年2月手術(shù)治療的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者90例，男52例，女38例；年齡20～75歲，中位年齡53歲；其中＜55歲共43例，≥55歲共47例；直腸癌37例，結(jié)腸癌53例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期48例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；分化程度：高分化63例，中低分化27例。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)直腸癌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 SantaCruz公司生產(chǎn)的人重組PTN細(xì)胞因子、PTN 單克隆抗體以及PTN多克隆抗體；西安沃爾森生物科技有限公司生產(chǎn)的原位雜交試劑盒、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、免疫組化試劑盒及無(wú)水乙醇；上海生工生物工程有限公司制造的PTN探針；浙江臨安電子器材廠制造的YWY781型醫(yī)用微波儀；德國(guó)Leica光學(xué)顯微鏡。

1.2.2 PTN mRNA檢測(cè) 原位雜交法：（1）二甲苯脫蠟處理石蠟切片，1 g/L蛋白酶K作用15 min；雙蒸水洗1 min后用無(wú)水乙醇洗2 min，吹干。（2）預(yù)雜交：預(yù)雜交液（50 μL）滴加在切片上，置于42 ℃恒溫箱孵育30 min，去除預(yù)雜交液。（3）雜交：雜交液（20 μL）滴加在切片上，硅化蓋玻片蓋好后放置在37 ℃濕暗盒中24 h。（4）免疫檢測(cè)：0.5 mL Buffer1清洗2 min后，滴加30 μL濃度為0.1 mol/L中性鹽溶液和10%聚乙二醇辛基苯基醚，再滴加1.0 mL Buffer1，室溫孵育30 min，滴加15 μL濃度為0.1 mol/L的NSS和45μL 10% TritonX-100，滴加Buffer1到1.5 mL，同時(shí)滴加50 μL抗地高辛抗體，室溫下孵育2 h；Buffer1清洗2次后Buffer3清洗，光學(xué)顯微鏡下，在暗盒內(nèi)監(jiān)控顯色反應(yīng)程度，細(xì)胞漿染色與細(xì)胞外背景表現(xiàn)為明顯差異時(shí)用Buffer4終止反應(yīng)；（5）核固紅襯染5 min，脫水后以中性樹(shù)膠封片。PTN 探針序列：地高辛標(biāo)記3′端，鎖核酸修飾中部“（T）”的堿基。陰性對(duì)照使用PBS替代雜交液。

1.2.3 PTN蛋白檢測(cè) 免疫組化染色法：參照文獻(xiàn)[5]采用微波-EliVision TM法進(jìn)行操作。陽(yáng)性對(duì)照為PTN蛋白陽(yáng)性表達(dá)的直腸癌組織，陰性對(duì)照為PBS代替一抗。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)[5]對(duì)原位雜交及免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。（1）PTN探針雜交陽(yáng)性：細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)淺藍(lán)色至深藍(lán)色顆粒。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野進(jìn)行測(cè)定平均陽(yáng)性反應(yīng)面積。陰性：陽(yáng)性面積≤20%；陽(yáng)性：陽(yáng)性面積＞20%。（2）免疫組化染色陽(yáng)性：細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)淺棕至深棕色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算平均陽(yáng)性染色細(xì)胞率。陰性：陽(yáng)性染色細(xì)胞率＜5%；弱陽(yáng)性：陽(yáng)性染色細(xì)胞率5%～25%；陽(yáng)性：陽(yáng)性染色細(xì)胞率25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性：陽(yáng)性染色細(xì)胞率＞50%。（3）染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色：1分，淡黃色：2分，淺棕色：3分，深棕色：4分。兩種計(jì)分相乘后，乘積值依次對(duì)應(yīng)0、2、6及12分，0和2為陰性，6和12為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTN mRNA及其蛋白表達(dá)結(jié)果 兩組組織芯片均能夠發(fā)現(xiàn)PTN mRNA表達(dá)（圖1、圖2）。PTN mRNA在正常結(jié)直腸組織中主要在黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)，而結(jié)直腸癌組織中，主要在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫性或灶性分布。PTN蛋白在正常結(jié)直腸組織中在正常腺體細(xì)胞的細(xì)胞漿進(jìn)行表達(dá)（圖3）；而在結(jié)直腸癌組織中，不僅表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也可表達(dá)（圖4）。

圖1 結(jié)直腸癌組織PTN mRNA表達(dá)

圖2 正常結(jié)直腸組織PTN mRNA表達(dá)

圖3 結(jié)直腸癌組織PTN蛋白表達(dá)

圖4 正常結(jié)直腸組織PTN蛋白表達(dá)

2.2 兩組PTN mRNA及其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 實(shí)驗(yàn)組PTN mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為62.2%，PTN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為58.9%，對(duì)照組分別為41.4%、34.3%，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 PTN mRNA及蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 通過(guò)觀察結(jié)直腸癌組織中PTN mRNA及其蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，年齡、性別及腫瘤類(lèi)型對(duì)PTN mRNA及其蛋白無(wú)顯著影響（P＞0.05）；而TNM分期、分化程度與PTN mRNA及其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有顯著關(guān)系（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 兩組PTN mRNA及其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 例（%）

表2 PTN mRNA及蛋白表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床高發(fā)惡性腫瘤之一，目前手術(shù)治療是其主要的治療方法，但治療效果較差。TNM分期及腫瘤分化是臨床上預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后的主要依據(jù)，也是進(jìn)行放化療的主要參考指標(biāo)。PTN基因主要分布在7q33～q34，其長(zhǎng)度超過(guò)100 kb，由5個(gè)外顯子和1個(gè)非翻譯的外顯子組成，PTN編碼氨基酸的蛋白質(zhì)共有168個(gè)，其中包含信號(hào)肽（32個(gè)氨基酸共同組成），PTN基因種屬不同呈現(xiàn)出高度保守的特點(diǎn)，PTN是已知的生長(zhǎng)因子中最保守的基因之一[4，6]。研究發(fā)現(xiàn)，PTN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，能夠?yàn)槟[瘤預(yù)后提供參考依據(jù)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常結(jié)直腸組織相比較，結(jié)直腸癌組織的PTN mRNA陽(yáng)性表達(dá)率和PTN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05）；TNM分期不同、分化程度不同，PTN mRNA及其蛋白陽(yáng)性表達(dá)存在顯著性，即分期越晚，分化程度越高，PTN mRNA及其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PTN是分泌性生長(zhǎng)、分化因子，與肝素具有高度親和作用，能夠促進(jìn)血管生成、改善神經(jīng)系統(tǒng)及骨發(fā)育情況，增強(qiáng)細(xì)胞增殖與遷移，在腫瘤患者中，PTN能夠?qū)-sis原癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞、子宮細(xì)胞DNA合成、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有絲分裂起促進(jìn)作用[9]。

目前有研究利用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)PTN顯性失活，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性表型能夠逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞周期減慢，提示PTN對(duì)染色體分離及細(xì)胞周期具有重要調(diào)控作用。也有研究發(fā)現(xiàn)大腦室管膜下層處于發(fā)育中的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞及室管膜細(xì)胞可檢測(cè)到PTN mRNA，提示PTN對(duì)大腦神經(jīng)、血管具有重要作用[9-10]。

綜上所述，PTN與結(jié)直腸癌的惡化程度具有密切關(guān)系，監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌患者PTN表達(dá)有利于正確判定結(jié)直腸癌患者預(yù)后。

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The Expression and Clinical Significance of Pleiotrophin （PTN） mRNA and Its Protein in Colorectal Carcinoma/

DONG Zi-long，WU Yan-ting，ZHANG Sheng-bin.//Medical Innovation of China，2014，11（08）：008-010

Objective：To discuss the expression and clinical significance of pleiotrophin （PTN） mRNA and its protein in colorectal carcinoma tissues.Method：90 cases of colorectal carcinoma（the exprimental group）and 70 cases of normal colorectal tissues（the control groups）were selected. The situ hybridization and immunohistochemical staining methods were used to detect PTN mRNA and protein expression in the two groups. 90 cases of primary colorectal carcinoma who under surgical treatment were selected，and the relationsnip of PTN mRNA and protein expression with chinical pathological characteristics of the colorectal cancer patients were analyzed.Result：In the experimental group， PTN mRNA positive expression rate was 62.2%， PTN protein positive expression rate was 58.9%， there was a statistically significant difference when compared with the control group （P＜0.05）. There were no significant differences in PTN mRNA and protein expression for different ages， genders and cancer types （P＞0.05）. There were significant differences in PTN mRNA and protein expression for different TNM staging and different degree of differentiation （P＜0.05）.Conclusion：PTN mRNA and protein is closely related to tumor stage and degree of differentiation， it can be used as the reference for judging prognosis ofcolorectal carcinoma.

Pleiotrophin； PTN protein； Colorectal carcinoma tissues

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.08.004

2014-01-16） （本文編輯：蔡元元）

①內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古 包頭 014010

董子龍

First-author’s address： The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China