郭飛翔，韓青青，黃玉軍，顧瑞霞，陳霞，魯茂林

（江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

黑米發(fā)酵乳的體外抗氧化活性研究

郭飛翔，韓青青，黃玉軍，顧瑞霞*，陳霞，魯茂林

（江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

對(duì)黑米發(fā)酵乳抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，當(dāng)黑米發(fā)酵乳、普通發(fā)酵乳及20%黑米酶解液3種樣品稀釋8倍時(shí)，黑米發(fā)酵乳清除DPPH·，清除·OH，總抗氧化能力，螯合Fe2+能力都是最強(qiáng)的，分別為60.16%，30.76%，0.847，28.43%，并且都顯著高于普通發(fā)酵乳和20%黑米酶解液的抗氧化能力。研究表明，黑米中的抗氧化功能成分與乳酸菌相互促進(jìn)，發(fā)揮了協(xié)同作用，提高了黑米發(fā)酵乳的功能特性。

黑米；發(fā)酵乳；抗氧化；體外

黑米是一種藥、食兼用的米，種植歷史悠久，是我國(guó)古老而名貴的糯米類稻米，俗稱“補(bǔ)血米”、“貢米[1]”。黑米中豐富的胡蘿卜素、葉綠素、花青素具有良好的生理功能特性，如防治缺鐵性貧血[2]，降血脂，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[3-5]，抗疲勞[6]，抗氧化[7-8]等。黑米發(fā)酵乳是將黑米經(jīng)過酶解，與牛乳混合后進(jìn)行發(fā)酵，牛乳蛋白質(zhì)作為全價(jià)優(yōu)質(zhì)蛋白，對(duì)谷物中必需氨基酸有互補(bǔ)作用，同時(shí)保留黑米的營(yíng)養(yǎng)成分，不僅使發(fā)酵乳口感更好，還可以補(bǔ)充牛乳碳水化合物，為人體提供豐富的膳食纖維、維生素及多種微量元素，并將黑米的功能特性在發(fā)酵乳中得到體現(xiàn)，開發(fā)黑米食品的新品種。盡管有研究人員從事黑米發(fā)酵乳的研究[9-11]，但大都只研究了黑米發(fā)酵乳的制作工藝，還沒有人對(duì)黑米發(fā)酵乳的抗氧化功能進(jìn)行研究。本研究通過對(duì)黑米發(fā)酵乳體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)，以期為黑米發(fā)酵乳產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑米購(gòu)自揚(yáng)州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；α-淀粉酶（20 000U/mL）購(gòu)自湖州禮來生物技術(shù)有限公司；糖化酶（100 000U/g）購(gòu)自張家港市金源生化有限公司；酸奶發(fā)酵菌種為揚(yáng)州大學(xué)乳品研究所分離保藏；脫脂乳粉，全脂乳粉購(gòu)自新西蘭威士蘭乳業(yè)公司；DPPH自由基購(gòu)自Sigma公司；無水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀、抗壞血酸、氯化鈉、氯化亞鐵、硫酸亞鐵、水楊酸和EDTA購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；菲洛嗪購(gòu)自上海生工生物有限公司。

1.2 設(shè)備

BOS-60攪拌機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；BS210S型電子天平（1/10000）：北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面工作凈化臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；755s型紫外分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；SHZ-Ⅲ B型循環(huán)水真空泵：上海儀（集團(tuán)）供銷公司；5804R型冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 樣品的制備

1.3.1 黑米酶解液的制備

黑米清洗兩遍，然后在55℃下浸泡2 h后趁熱磨漿，過20目篩，加水調(diào)整料水比為1∶4，在80℃的水浴鍋中糊化30min，用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)糊化液pH，加入高溫α-淀粉酶95℃下液化，以碘液檢驗(yàn)至所需DE值后煮沸5min～10min，快速冷卻，用10%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH，再加入糖化酶進(jìn)行糖化，用無水乙醇檢驗(yàn)至無白色沉淀后，經(jīng)85℃熱處理10min滅去酶的活力，過100目篩制得黑米酶解液，最后用飽和Na2CO3調(diào)節(jié)其pH為6.4～6.8，備用。

1.3.2 普通發(fā)酵乳的制備

全脂乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖5.0%）95℃殺菌5min，冷卻至42℃，并按體積分?jǐn)?shù)3%接入菌種，于42℃培養(yǎng)至pH為4.5左右，迅速置于冰水中冷卻至4℃，并于4℃冷藏24 h。

1.3.3 黑米發(fā)酵乳的制備

全脂乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖5.0%，黑米酶解液20%），95℃殺菌5min，冷卻至42℃，并按體積分?jǐn)?shù)3%接入菌種，于42℃培養(yǎng)至pH為4.5左右，迅速置于冰水中冷卻至4℃，并于4℃冷藏24 h。

1.4 樣品的處理

稱取冷藏24 h后的黑米發(fā)酵乳和普通發(fā)酵乳各100 g，采用減壓抽濾的方式進(jìn)行過濾，并收集濾液，將濾液分別稀釋至0倍、4倍、8倍、12倍、16倍；將黑米酶解液與雙蒸水按1∶4的比例配成20%的黑米酶解液，同時(shí)也稀釋至0倍、4倍、8倍、12倍、16倍。

1.5 黑米發(fā)酵乳抗氧化活性的測(cè)定

1.5.1 黑米發(fā)酵乳對(duì)DPPH·的清除能力

參照文獻(xiàn)[12]所述方法并略做改動(dòng)，取樣品2.0mL與2.0mL95%乙醇混勻，再加入濃度0.2mmol/LDPPH溶液2.0mL于具塞試管中，搖勻，避光放置30min后，3 000 r/min條件下離心10min，用95%乙醇作參比測(cè)定其吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定0.2mmol/LDPPH溶液與等體積95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測(cè)液與等體積95%乙醇混合液在517 nm處的吸光度Aj。本研究以VC為對(duì)照。DPPH·清除率用下式表示：

1.5.2 黑米發(fā)酵乳對(duì)·OH的清除能力

參照文獻(xiàn)[13]所述方法，將2mL的6mmol/L硫酸亞鐵水溶液與2mL的6mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合后，將樣品加入后，再加入2mL的20mmol/L的過氧化氫溶液，混勻后在37℃的恒溫水浴中反應(yīng)1 h時(shí)，3 000 r/min條件下離心10min，取出冷卻后在510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2。同時(shí)測(cè)定不加樣品只加H2O2時(shí)的吸光值A(chǔ)1，以及用雙蒸水做空白對(duì)照時(shí)的吸光度A0。本研究以VC為對(duì)照?！H清除率用下式表示：

1.5.3 黑米發(fā)酵乳總抗氧化能力

參照文獻(xiàn)[14]所述方法并略做改動(dòng)，將樣品1.0mL與2.0mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）混合，再加入1%的鐵氰化鉀2.0mL?；旌衔镉?0℃水浴20min后，加入1.0mL10%的三氯乙酸，4 000 r/min 10min，取上清液2.5mL，加雙蒸水2.5mL和0.1%的FeCl30.5mL反應(yīng)10min后，700 nm處測(cè)吸光度。吸光度越高，說明反應(yīng)混合物的還原性越強(qiáng)，樣品的總抗氧化能力越強(qiáng)。

1.5.4 黑米發(fā)酵乳對(duì)Fe2+螯合能力

參照文獻(xiàn)[15]所述方法并略做改動(dòng)，取2mL樣品，加入2mL 0.01mmol/LFeCl2·4H2O溶液和2mL 0.25mmol/L菲洛嗪，振蕩混勻。反應(yīng)混合物靜置10min，在562 nm下測(cè)定吸光度As，用雙蒸水做空白對(duì)照測(cè)定吸光度Ac。本研究以EDTA為對(duì)照。Fe2+鰲合能力用下式表示：

1.5.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米發(fā)酵乳對(duì)DPPH·的清除能力

將制備的不同稀釋倍數(shù)的黑米發(fā)酵乳、普通發(fā)酵乳的濾液及20%黑米酶解液及VC（0.006mg/mL）對(duì)DPPH·清除能力進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果如圖1。

圖1 不同樣品對(duì)DPPH·的清除活性Fig.1 Scavenging effect of different samples against the DPPH· radical

由圖1可以看出，3種樣品對(duì)DPPH·的清除能力與樣品的稀釋倍數(shù)成線性關(guān)系。未經(jīng)稀釋時(shí)，黑米發(fā)酵乳對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到94.51%，而黑米酶解液和普通發(fā)酵乳的清除率分別為90.96%和88.01%，隨著稀釋倍數(shù)的增加，即樣品濃度的減小，樣品對(duì)DPPH·的清除能力減弱。當(dāng)稀釋到8倍時(shí)，黑米發(fā)酵乳清除率為60.16%，與濃度為0.006mg/mL的VC清除能力相當(dāng)（p＞0.05），并且黑米發(fā)酵乳與其他兩種樣品清除DPPH·的能力均存在著顯著性差異（p＜0.05）。

2.2 黑米發(fā)酵乳對(duì)·OH的清除能力

將制備的不同稀釋倍數(shù)的黑米發(fā)酵乳、普通發(fā)酵乳濾液及20%黑米酶解液樣品及VC（6mg/mL）對(duì)·OH的清除能力進(jìn)行測(cè)定，同樣三種樣品對(duì)·OH的清除能力與樣品的稀釋倍數(shù)成線性關(guān)系。樣品稀釋8倍時(shí)，其清除·OH結(jié)果如圖2。

圖2 不同樣品對(duì)·OH的清除活性Fig.2 Scavenging effect of different samples against the hydroxyl radical

由圖2可以看出，三種樣品存在不同的·OH清除能力。當(dāng)樣品稀釋8倍時(shí)，黑米發(fā)酵乳對(duì)·OH清除率30.76%，與濃度為6mg/mL的VC清除能力相當(dāng)（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液21.03%，普通發(fā)酵乳18.49%，并且黑米發(fā)酵乳與其他兩種樣品清除·OH能力存在顯著性差異（p＜0.05）。

2.3 黑米發(fā)酵乳對(duì)總抗氧化能力

將制備的不同稀釋倍數(shù)的黑米發(fā)酵乳、普通發(fā)酵乳濾液及20%黑米酶解液樣品及VC（0.15mg/mL）的總抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，同樣三種樣品的總抗氧化能力與樣品的稀釋倍數(shù)成線性關(guān)系。樣品稀釋8倍時(shí)，其總抗氧化能力結(jié)果如圖3。

圖3 不同樣品的總抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of different samples

由圖3可以看出，三種樣品存在一定的總抗氧化能力。當(dāng)樣品稀釋8倍時(shí)，黑米發(fā)酵乳的總抗氧化能力最強(qiáng)，為0.847，與濃度為0.15mg/mL的VC清除能力相當(dāng)（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液0.642，普通發(fā)酵乳0.466，并且黑米發(fā)酵乳與其他兩種樣品總抗氧化能力存在顯著性差異（p＜0.05）。

2.4 黑米發(fā)酵乳對(duì)Fe2+螯合能力

將制備的不同稀釋倍數(shù)的黑米發(fā)酵乳、普通發(fā)酵乳濾液及20%黑米酶解液樣品及EDTA（0.02mg/mL）對(duì)亞鐵離子螯合能力進(jìn)行測(cè)定，同樣三種樣品對(duì)Fe2+螯合能力與樣品的稀釋倍數(shù)成線性關(guān)系。樣品稀釋8倍時(shí)，其螯合能力結(jié)果如圖4。

圖4 不同樣品的亞鐵離子螯合能力Fig.4 Ferrous ion chelating capacities of different samples

如圖4可以看出，三種樣品存在一定的Fe2+螯合能力。當(dāng)樣品稀釋8倍時(shí)，黑米發(fā)酵乳的螯合能力最強(qiáng)，為28.43%，與濃度為0.02mg/mL的EDTA的螯合能力相當(dāng)（p＞0.05），其次是20%黑米酶解液9.62%，而普通發(fā)酵乳的螯合率只有4.51%，黑米發(fā)酵乳螯合Fe2+能力接近為它的7倍。

3 討論

對(duì)黑米發(fā)酵乳、普通發(fā)酵乳及20%黑米酶解液三種樣品的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，黑米發(fā)酵乳體外抗氧化能力是三種樣品中最強(qiáng)的。其中黑米發(fā)酵乳的抗氧化能力比20%黑米酶解液強(qiáng)，說明乳酸菌的發(fā)酵能提高黑米酶解液的抗氧化活性；黑米發(fā)酵乳的抗氧化能力比普通發(fā)酵乳強(qiáng)，尤其是體現(xiàn)在兩者螯合亞鐵離子的能力上，黑米發(fā)酵乳是普通發(fā)酵乳的7倍，說明黑米中功能性成分發(fā)揮了作用。

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In Vitro Study on the Antioxidant Activities of Fermented Black Rice Milk

GUO Fei-xiang，HAN Qing-qing，HUANG Yu-jun，GU Rui-xia*，CHEN Xia，LU Mao-lin
（Jiangsu Province Key Lab of Dairy Biotechnology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

Based on the in vitro experiments，the antioxidant activities of fermented black rice milk was studied. The results showed that when fermented black rice milk，ordinary fermented milk and 20% of black rice juice were diluted 8 times，the fermented black rice milk had the most antioxidant activities in three samples.The fermented black rice milk scavenging DPPH，hydroxyl radicals，reducing power and chelating ferrous ion were 60.16%，30.76%，0.847，28.43%and obviously higher than the other samples.It showed that the antioxidant functional composition of black rice and lactic acid bacteria played a synergy and improved the functional characteristics of the fermented black rice milk when they were mixed.

black rice；fermented milk；antioxidant；in vitro

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.002

2012-12-15

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD18B12）；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2011383）；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(12KJA550003);教育部博士點(diǎn)基金（20093250110005）；青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201393）

郭飛翔（1990—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：乳品科學(xué)。

*通信作者：顧瑞霞（1963—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：乳品科學(xué)。