魏春雁，孟繁磊，樊慧梅，牛紅紅，宋志峰

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室 長春 130033)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZON)又稱F-2毒素，是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種類雌激素樣真菌毒素，具有遺傳毒性、能致癌、導(dǎo)致DNA收斂和染色體失常等危害[1]。在動物及人體內(nèi)，ZON可以代謝為α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol，α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenol，β-ZOL)及其他產(chǎn)物，而在植物體內(nèi)ZON主要代謝為α-ZOL[2-4]。

國內(nèi)外報道的ZON及其代謝產(chǎn)物檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)[3-9]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[10]、毛細(xì)管電泳法 (CE)[11]、薄層色譜法(TLC)[12]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[13]等。其中單獨測定ZON時，HPLC使用最為廣泛。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)由于其具有檢測靈敏度高、定性定量兼顧和可多組分同時檢測等優(yōu)點，因此近年來成為多種真菌毒素同時測定研究的熱點[14-18]。真菌毒素檢測中一個十分關(guān)鍵的步驟是樣品提取液的凈化，它將直接影響到分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前文獻(xiàn)報道的凈化技術(shù)大多采用固相萃取的方法，這種凈化方法雖然操作簡便，但是成本較高，尤其是通常使用的免疫親和柱價格更是昂貴，使一般實驗室很難接受。本文通過參考文獻(xiàn)[19]，采用經(jīng)典的液液萃取方法對樣品進(jìn)行提取和凈化，經(jīng)HPLC-MS/MS分離和檢測，實現(xiàn)了糧油食品中α-ZOL和ZON快速準(zhǔn)確測定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(HPLC)、6410B三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國 Agilent公司)；BT124S電子分析天平，感量0.1mg(德國Sartorius公司)；PL602電子分析天平，感量0.01 g(梅特勒托利多儀器 (上海)有限公司)；RVO6-ML全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司)；HSC-24B氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；NR常溫振蕩提取器 (日本TAITEC公司)；VORTEX3000渦旋混勻器(德國 WIGGENS公司)；125 mL分液漏斗(天津天玻玻璃儀器有限公司)。

HPLC級乙腈(賽默飛世爾(中國)有限公司)；分析純二氯甲烷、三氯甲烷、無水硫酸鈉、氯化鈉、一水合檸檬酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、玉米赤霉烯酮(ZON)，純度≥99%(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)；0.22μm有機(jī)濾膜(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 溶液配制

飽和氯化鈉溶液：稱取36 g氯化鈉容于100 mL水中。2%氫氧化鈉溶液：稱取20 g氫氧化鈉用水溶解并定容至1 L。106 g/L檸檬酸溶液：稱取106 g一水合檸檬酸用水溶解并定容至1 L。50%乙腈溶液：取500 mL乙腈和500 mL水混合。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量(精確至0.000 1 g)用乙腈溶解，配制成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。0～4℃避光保存，有效期為6個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量(精確至0.000 1 g)，于一組容量瓶中，用50%乙腈溶液至刻度，配制成濃度為1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(Rapid Resolution HT 100 mm×2.1 mm，1.8μm)。柱溫：40℃。流動相A：10%乙腈(v/v)水溶液；流動相B：乙腈(色譜純)；梯度洗脫程序：0～5 min，流動相B由50%～75%；5～5.1 min，流動相 B由 75%～100%；5.1～10.1 min，流動相B保持為 100%；10.1～10.2 min，流動相 B由 100%～50%；10.2～18 min，流動相B保持為50%。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣量：20μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：350℃；干燥氣流量：10 L/min；監(jiān)測離子、去簇電壓及碰撞能量等見表1。

表1 α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)和玉米赤霉烯酮(ZON)監(jiān)測離子、去簇電壓及碰撞能量

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取樣品10 g(精確至0.01 g)于100 mL具塞錐形瓶中。固體加入50 mL三氯甲烷，植物油脂等液體樣品加入35 mL三氯甲烷，蓋緊塞子，于振蕩提取器上室溫振蕩(180 r/min)提取30 min。

1.4.2 凈化

使用中速濾紙過濾提取液并用三氯甲烷定容至50 mL。吸取25.0 mL提取液至125 mL分液漏斗中，加入5 mL飽和氯化鈉溶液，混勻。加入25 mL 2%氫氧化鈉溶液，劇烈振蕩1 min，靜置分層，棄去三氯甲烷層。用25 mL三氯甲烷重復(fù)萃取一次，棄去三氯甲烷層。加入25 mL 106g/L檸檬酸溶液，混勻。加入25 mL二氯甲烷，劇烈振蕩1 min，靜置分層。將二氯甲烷層溶液通過裝有5 g無水硫酸鈉的漏斗。用25 mL二氯甲烷重復(fù)萃取一次，操作同上。用5 mL二氯甲烷沖洗無水硫酸鈉，合并二氯甲烷萃取液至濃縮瓶中，40℃以下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干。殘留物用5 mL二氯甲烷溶解并轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中，于40℃以下用氮氣吹干，殘留物用1.0 mL 50%乙腈溶液溶解，于漩渦混合器上漩渦混勻后，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

1.5 定性和定量

1.5.1 定性分析

按照1.3的分析條件對標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品進(jìn)行測定，當(dāng)樣品目標(biāo)化合物的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜峰保留時間偏差±5%范圍內(nèi)、定性離子對的相對豐度符合歐盟關(guān)于食品中污染物的確認(rèn)要求[20]，則可判定樣品中存在相應(yīng)的化合物。α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)工作液多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1。

圖1 10μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液中α-ZOL(a、b)和ZON(c、d)特征離子質(zhì)量色譜圖

1.5.2 定量分析

按濃度由小到大的順序，按照1.3的分析條件依次對標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時按相同條件對樣品測定液進(jìn)行測定，利用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品中目標(biāo)化合物按照外標(biāo)法進(jìn)行定量。高濃度樣品應(yīng)適當(dāng)稀釋，保證被測組分在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對掃描方式、離子源溫度和干燥氣溫度等進(jìn)行了優(yōu)化，確定出最佳的質(zhì)譜條件。對α-ZOL和ZON去簇電壓、碰撞能量等進(jìn)行了優(yōu)化，同時參考文獻(xiàn)[15-16]篩選出最佳的定性和定量離子對。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

比較了甲醇和水、乙腈和水作為流動相的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)兩者相當(dāng)。由于使用窄徑色譜柱分離，甲醇和水作為流動相時系統(tǒng)壓力較高，對系統(tǒng)易造成損害，因此選擇了乙腈和水系統(tǒng)作為流動相。

2.2.2 洗脫方式的選擇

對于α-ZOL和ZON，采用50%乙腈等度系統(tǒng)和梯度洗脫時分離效果相當(dāng)，等度洗脫時分析時間較長，同時梯度洗脫可有效除去極性較弱的雜質(zhì)，因此選擇了梯度洗脫的方式。

2.2.3 色譜柱的選擇

比較了50 mm、100 mm和150 mm 3種不同規(guī)格的窄徑C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)100 mm分離效果較好，且分析較短，4 min之內(nèi)α-ZOL和ZON便可得到良好的分離，因此選擇了100 mm×2.1 mm(粒徑1.8μm)的C18色譜柱作為分析柱。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

在空白玉米樣品中加入一定濃度的α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比較了三氯甲烷、乙腈、無水乙醚三種提取溶劑的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三氯甲烷和乙醚對α-ZOL與ZON提取效率較高且相當(dāng)，乙腈稍差，考慮到乙醚揮發(fā)性高，操作過程中不易控制，因此選擇了三氯甲烷作為提取溶劑。

2.3.2 提取時間的選擇

在空白玉米樣品中加入一定濃度的α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以三氯甲烷為提取溶劑，在室溫振蕩條件下提取，比較了10 min、20 min、30 min、45 min、60 min的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著提取時間的增加，α-ZOL與ZON的提取效率不斷提高，30 min以后提取效率達(dá)到最高，以后不再增加，因此確定30 min作為提取時間。

2.3.3 萃取劑的選擇

α-ZOL和ZON在弱堿性水溶液中的溶解性高于有機(jī)溶劑，因此選擇氫氧化鈉作為第一次萃取的溶液，以除去脂類和色素等脂溶性的雜質(zhì)。在空白玉米樣品中加入一定濃度的α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用三氯甲烷室溫下振蕩提取30 min，以二氯甲烷為反萃取溶劑，對0.5%、1%、2%和3%4種濃度的氫氧化鈉的萃取效率進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉的濃度為2%時較為合適。

2.3.4 反萃取溶劑的選擇

在空白玉米樣品中加入一定濃度的α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用三氯甲烷室溫振蕩提取30 min，以2%氫氧化鈉為萃取劑，比較了分別以二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲醇作為反萃取溶劑時的萃取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氯甲烷與三氯甲烷反萃取的效率最高，且兩者相當(dāng)，考慮到二氯甲烷沸點更低便于旋蒸濃縮，因此選擇二氯甲烷作為反萃取溶劑。

2.4 線性關(guān)系、檢出限、回收率及精密度

配制了 0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 等濃度的α-ZOL和ZON混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.50 ng/mL～50 ng/mL 2個化合物線性范圍良好，線性回歸方程分別為Y=183.72X-11.04(r2=0.999)和 Y=337.59X+21.21(r2=0.998)；以定性離子的信噪比≥3時確定2個化合物的檢出限分別為1.5μg/kg和 1.0 μg/kg。

表2 不同基質(zhì)空白樣品中α-ZOL和ZON添加回收率及精密度(n=6)

在玉米、大豆、大米、大豆油、玉米色拉油等空白樣品中加入3倍檢出限、6倍檢出限和30倍檢出限左右濃度的α-ZOL和ZON標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照優(yōu)化后的前處理和儀器分析條件進(jìn)行回收率與精密度實驗，結(jié)果見表2。由表2可以看出，2個化合物的不同水平加標(biāo)回收率在70%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5%～10%之間，滿足準(zhǔn)確定量分析的要求。

2.5 實際樣品測定

在市場上采集了吉林省內(nèi)生產(chǎn)的玉米、大豆、大米、大豆油和玉米色拉油等樣品各3份，按照建立的分析方法對15份樣品進(jìn)行了α-ZOL和ZON殘留量的測定。其中1份明顯發(fā)霉玉米檢出了α-ZOL和ZON，含量分別為 12.1μg/kg和220.3μg/kg，另有 1份大米僅檢出了 ZON，含量為5.0μg/kg，其他樣品均未檢出。

3 結(jié)論

本文利用HPLC-MS/MS儀器建立的糧油食品中α-ZOL和ZON檢測方法，靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠，能夠滿足糧油食品中痕量污染物的檢測要求。經(jīng)典的液液萃取和凈化方法，降低了檢測成本，有利于本方法的推廣和應(yīng)用。

利用本方法對采集自吉林省內(nèi)生產(chǎn)的玉米等15份樣品測定的結(jié)果表明，1份發(fā)霉玉米樣品檢出了較高含量的α-ZOL和ZON，1份大米樣品檢測含量較低的ZON，其他樣品均未檢出。這可能是由于北方氣溫和空氣濕度相對較低，在貯藏和加工條件適宜的情況下，糧油食品中一般不會發(fā)生α-ZOL和ZON的污染。

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