王天山，邢彥彬，譚志勇，唐望昌，蘇美多，葉飛，李雯雯，宋小平

（海南省熱帶藥用植物化學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南?？?71158）

幾種含芳香環(huán)天然化合物清除自由基的活性

王天山，邢彥彬，譚志勇，唐望昌，蘇美多，葉飛，李雯雯，宋小平*

（海南省熱帶藥用植物化學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南海口571158）

探討含芳香環(huán)抗氧化劑不同取代基對(duì)其抗氧化活性的影響，選擇研究了五種含有苯環(huán)的天然化合物（Diayangambin，鵝掌楸樹脂醇A二甲醚，N-反式-阿魏?；野?，香蘭素和沒食子酸三甲醚）對(duì)自由基的清除能力，以鄰苯三酚的自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子及Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基作為模擬自由基，以VC作為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測量這五種化合物對(duì)這兩種自由基的清除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各種天然化合物對(duì)這兩種自由基的清除率均隨濃度的增大而增加，其中前四種物質(zhì)對(duì)超氧自由基的清除活性基本與VC相當(dāng)，而沒食子酸三甲醚對(duì)羥基自由基清除活性則最強(qiáng)。沒食子酸三甲醚對(duì)羥基自由基的半清除濃度EC50值只有1.24×10-6mg/mL，而VC的EC50值則高達(dá)3.48×10-4mg/mL。研究發(fā)現(xiàn)在含苯環(huán)的抗氧化劑中，在苯環(huán)4位的取代基是甲氧基或者是羥基時(shí)對(duì)抗氧化活性的作用基本相似，而如果在苯環(huán)1位的取代基是羧基時(shí)則能明顯增強(qiáng)其抗氧化活性。

天然抗氧化劑；沒食子酸三甲醚；自由基；紫外分光光度法

自由基是含有一個(gè)不成對(duì)電子的原子團(tuán)，具有強(qiáng)的氧化性?？寡趸瘎┛梢郧宄杂苫?，防止食品氧化和延長食品保質(zhì)期，提高食品的品質(zhì)，保持原有的風(fēng)味與延長物質(zhì)的儲(chǔ)存期。天然抗氧化劑的毒性遠(yuǎn)低于人工合成的抗氧化劑，其中大部分抗氧化劑均具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和至少有一個(gè)羥基[1]。近年來從自然界尋找天然抗氧化劑已經(jīng)受到各國科學(xué)工作者的重視，其產(chǎn)品也得到人們的青睞[2]。前期從海南香花暗羅的提取物中分離得到五種含有芳香環(huán)的天然化合物：Diayangambin（1），鵝掌楸樹脂醇A二甲醚（2），N-反式-阿魏?；野罚?），香蘭素（4）和沒食子酸三甲醚（5）[3]。這五種化合物均含有一個(gè)或者兩個(gè)苯環(huán)，其中化合物1和2屬于木脂素類化合物，化合物3屬于羥基肉桂酸的衍生物，化合物5是沒食子酸的衍生物，此類型的化合物均在一定的程度上具有抗氧化的作用[4-7]。在這些化合物的苯環(huán)上的取代基有些是相同的，有些是不同的；本研究主要對(duì)比這些取代基對(duì)該化合物抗氧化作用的影響，為合理設(shè)計(jì)高效的抗氧化劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

鹽酸（36％～38％）：分析純，廣州市東江化工廠；三羥甲基-氨基甲烷（Tris）：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚（PR）：ALaddin Chemistry Co. Ltd.；甲基紫，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；維生素C：分析純，天津市四通化工廠；H2O2（30％）：分析純，西隴化工股份有限公司；Fe（NH4）2（SO4）2：由海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試品：Diayangambin，鵝掌楸樹脂醇A二甲醚，N-反式-阿魏?；野?，香蘭素和沒食子酸三甲醚均由海南省熱帶藥用植物化學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，是從香花暗羅（Polyalthia rumphii）莖皮的氯仿部位分離得到。

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)（UV2600型）：上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)超氧陰離子（O2-·）清除率的測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化并釋放出O2-·，并且生成有色的中間產(chǎn)物；當(dāng)有清除劑存在時(shí)，可與O2-·反應(yīng)，從而阻止中間產(chǎn)物的積累。因此可以通過測定溶液的吸光值在加入清除劑前后的變化來判斷清除劑的清除效果。按表1進(jìn)行溶液配置，分別得到等量的空白溶液、供試品溶液和本底。量取4mL空白溶液置于1 cm比色杯中，以水作對(duì)照，經(jīng)紫外-可見全波長（200 nm～800 nm）掃描，在λ=321 nm處有最大吸收，因此選擇321 nm作為測定波長。在配置溶液4min時(shí)測試溶液的吸光度A321。在測試供試品的吸光度A樣時(shí)需要扣除本底的吸光度A底，目的是消除供試品自身在321 nm的吸收。供試品清除率的計(jì)算式為：

表1 抑制鄰苯三酚自身氧化的條件Table1 Conditions of inhibiting pyorgallol autoxidation

1.3.2 對(duì)羥基自由基（OH·）清除率的測定

Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH·與甲基紫作用后使其吸光度降低，加入清除劑清除OH·后，使吸光度升高，利用反應(yīng)前后吸光度值的變化來測定清除率。甲基紫溶液經(jīng)紫外-可見光全波長（200 nm～800 nm）掃描，在244 nm處有最大吸收，故選擇244 nm為測定波長。

量取50mL甲基紫溶液（0.3×10-3mol/L）稀釋至200mL，測得反應(yīng)前甲基紫溶液的吸光度為A；量取50mL甲基紫溶液（0.3×10-3mol/L），加入25mLFe2+溶液（1.0×10-3mol/L）和25mLH2O2溶液（0.1％），用100mL水稀釋到200mL，測得反應(yīng)后甲基紫的吸光度為A0；量取50mL甲基紫溶液（0.3×10-3mol/L），加入25mL Fe2+溶液（1.0×10-3mol/L）和25mLH2O2溶液（0.1％）混合均勻后取1.5mL與1.5mL供試品溶液混合，測得吸光度為AS。則供試品對(duì)的清除率按下式進(jìn)行計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

圖1是五種供試品和維生素C對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率，其中維生素C是作為對(duì)照品。從圖1可以看出，隨樣品溶液濃度的增大其對(duì)自由基的清除率也隨之增強(qiáng)，并且供試品與對(duì)照品對(duì)羥基自由基的清除能力比對(duì)超氧自由基的能力強(qiáng)。左圖顯示，Diayangambin（1），N-反式-阿魏酰基酪胺（3），香蘭素（4）和沒食子酸三甲醚（5）對(duì)超氧陰離子自由基的清除率與維生素C基本相當(dāng)，而鵝掌楸樹脂醇A二甲醚（2）對(duì)超氧陰離子自由基的清除率則相對(duì)較弱，大約只有維生素C的一半。右圖顯示，化合物1，2，3和4對(duì)羥基自由基的清除率比維生素C弱，其強(qiáng)度只有維生素C的50％～60％；相比之下，化合物5對(duì)羥基自由基的清除活性最強(qiáng)，其半清除濃度EC50是1.24×10-6mg/mL，而維生素C的EC50則是3.48×10-4mg/mL，可見5對(duì)羥基自由基的EC50值只有維生素C的1/280，其活性遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素C。

圖1 供試品和維生素C對(duì)超氧自由基和羥基自由基的清除率Fig.1 Clearance rate of superoxide anion free radicals and hydroxyl radicals by samples and vitamin C

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒食子酸三甲醚對(duì)羥基自由基的EC50值只有維生素C的1/280，而沒食子酸對(duì)DPPH自由的EC50值是維生素C的1/5[7]；從這方面看，沒食子酸三甲醚對(duì)自由基清除活性比沒食子酸還要強(qiáng)，可見沒食子酸三甲醚亦是一種強(qiáng)的天然抗氧化劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

在含苯環(huán)的天然抗氧化劑中，苯環(huán)的4位連一個(gè)羥基會(huì)增強(qiáng)其抗氧化活性的能力，有利于與自由基反應(yīng)后生成穩(wěn)定的半醌自由基[8]。本研究選擇五種具有苯環(huán)的天然化合物作為供試品，以維生素C作為對(duì)照品，通過對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化活性的強(qiáng)弱。在這五種含苯環(huán)的天然化合物中，化合物3和4的對(duì)位是羥基，而化合物1，2和5的4位是甲氧基；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這五種化合物對(duì)這兩種自由基均具有不同程度的清除能力，這說明苯環(huán)上連有羥基或者是甲氧基時(shí)對(duì)抗氧化活性的作用基本相同。如果苯環(huán)4位連的是羥基，與自由基反應(yīng)時(shí)失去氫而形成半醌自由基，如果連的是甲氧基，則可失去甲基而形成半醌自由基。在這五種抗氧化活性物質(zhì)的苯環(huán)上存在明顯差異的是1位的取代基，化合物1，2和3的取代基是烷基和烯基，這兩種取代不能穩(wěn)定半醌自由基，因此抗氧化活性不強(qiáng)；化合物4和5的取代基均是羰基，但是5的抗氧化活性遠(yuǎn)強(qiáng)于4，可能是因?yàn)?在溶液中能夠通過羧基的氫鍵形成二聚體使半醌自由基更加穩(wěn)定，而4在溶液里則主要是以游離態(tài)存在而無法使半醌自由基更加穩(wěn)定。

通過比較幾種含有苯環(huán)的天然化合物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)的4位是羥基或者是甲氧基不能明顯影響其抗氧化活性；影響其抗氧化活性的主要因素是苯環(huán)1位的取代基，若1位連的是具有強(qiáng)電子效應(yīng)并能使半醌自由基更加穩(wěn)定的取代基（如羧基）時(shí)可明顯增強(qiáng)其抗氧化活性。此研究結(jié)果可為如何設(shè)計(jì)強(qiáng)抗氧化劑提供理論依據(jù)，既可以通過修飾苯環(huán)1位上的取代基來改變其抗氧化活性，亦可以通過烷基化苯環(huán)上的羥基來增強(qiáng)其脂溶性。

[1]國際藥用輔料網(wǎng).天然抗氧化劑的研發(fā)及市場應(yīng)用前景[OL]. http://news.chemnet.com/item/2010-07-27/1385774.html.2010年07月27日

[2]陸奕娜.天然抗氧化植物化學(xué)物的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2011,33(9):238-243

[3]Wang T S,Yuan Y,Wang J,et al.Anticancer activities of constituents from the stem of Polyalthia rumphii[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2012,25(2):353-356

[4]徐冰,楊盼盼,王佩龍,等.五味子科木脂素類化合物抗氧化活性研究[J].四川中醫(yī),2012,30(5):52-54

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Study on the Radical Scavenging Activities by Several Natural Aromatic Compounds

WANG Tian-shan，XING Yan-bin，TAN Zhi-yong，TANG Wang-chang，SU Mei-duo，YE Fei，LI Wen-wen，SONG Xiao-ping*
（Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158，Hainan，China）

On the purpose of investigating the impact factors of anti-oxidant activities by aromatic antioxidants with different substitutents，five natural aromatic compounds（Diayangambin，Epiyangambin，N-transferuloyltyramine，Vanillin and 3，4，5-trimethoxy benzoic acid）were selected to be natural antioxidants to scavenge free radicals.The anti-oxidant activities were evaluated by UV spectrophotometry，applying vitamin C as control，and the model free radicals were superoxide anion free radical from pyrogallol autooxidation under alkaline condition，and hydroxyl radical from Fenton reaction.The experimental results showed that all five natural compounds indicated activities to these two free radicals，the former four compounds showed activities to superoxide anion free radical，which were nearly to that of vitamin C；furthermore，3，4，5-trimethoxy benzoic acid showed very strong activity to hydroxyl radical with the EC50value of1.24×10-6mg/mL，which was stronger than that of vitamin Cwith the EC50value of3.48×10-4mg/mL.By comparing the anti-oxidant activities with the relevant natural compounds，the contribution to anti-oxidant activity of methoxyl group substituting at para-position of phenyl group was similar to that of hydroxyl group.Indeed，a strong electron-attracting group（such as carboxyl group），located at the primary position of benzene ring，can strengthen the anti-oxidant activity obviously.

natural antioxidants；3，4，5-trimethoxy benzoic acid；free radicals；UV spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.002

2012-12-18

海南省自然基金項(xiàng)目（213018）；海南省教育廳高等學(xué)校科研項(xiàng)目（Hjkj2010-25）

王天山（1979—），男（漢），副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

*通信作者