馬曉建 張霞，2 常春

(1.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州450001;2.華北水利水電大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究所，河南鄭州450011)

丁醇不僅是一種重要的有機(jī)溶劑和化工原料［1］，還是一種新型的極具潛力的生物燃料.其熱值遠(yuǎn)高于乙醇(與汽油相當(dāng))，腐蝕性小，蒸氣壓低，能與汽油以任意比互摻使用［2-5］.丙酮丁醇發(fā)酵是一項(xiàng)傳統(tǒng)的大宗發(fā)酵［6］，我國(guó)在建國(guó)初期已經(jīng)以玉米淀粉為原料進(jìn)行穩(wěn)定的丁醇工業(yè)化生產(chǎn).隨著石化資源的耗竭、糧油的短缺以及溫室效應(yīng)等環(huán)境問題的日益突出，利用可再生資源、農(nóng)業(yè)廢棄物等生產(chǎn)化工原料和能源物質(zhì)越來越受到重視［7］.

利用木質(zhì)纖維素等生物質(zhì)發(fā)酵丁醇已成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)［8-12］.菌種、原料、原料預(yù)處理方式以及發(fā)酵條件等均會(huì)對(duì)溶劑產(chǎn)量產(chǎn)生顯著的影響.利用丙酮丁醇梭菌ATCC824(Clostridium acetobutylicum ATCC824)發(fā)酵糖楓樹水解液生產(chǎn)丁醇，丁醇濃度可達(dá)到7 g/L［10］.利用拜氏梭菌P260(Clostridium beijerinckii P260)對(duì)大麥和小麥秸稈的稀酸水解液進(jìn)行發(fā)酵后，大麥秸稈水解液中的ABE(Acetone，Butanol，Ethanol)生成率僅為0.1 g/(L·h)，而小麥秸稈水解液中的生成率可達(dá)到0.6 g/(L·h)，但是大麥稈水解液經(jīng)過Ca(OH)2脫毒并添加葡萄糖(葡萄糖濃度15.1 g/L)后，丁醇濃度可達(dá)17g/L［9］.丙酮丁醇梭菌 CICC8016(Clostridium acetobutylicum CICC8016)發(fā)酵玉米秸稈水解液，丁醇濃度為4.54g/L［13］.通過響應(yīng)面法優(yōu)化丙酮丁醇梭菌CICC8008(Clostridium acetobutylicum CICC8008)發(fā)酵經(jīng)氨水預(yù)處理的玉米秸稈生產(chǎn)丁醇的條件，丁醇濃度可以達(dá)到6.2g/L［14］.

水蒸氣爆破法是將生物質(zhì)經(jīng)高溫高壓水蒸氣處理一定時(shí)間，然后瞬間泄壓，從而實(shí)現(xiàn)原料組分的化學(xué)分離、機(jī)械分裂和結(jié)構(gòu)重排［15］.文中以水蒸氣爆破的玉米秸稈酶解液為發(fā)酵原料，選擇適合水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液發(fā)酵生產(chǎn)高濃度丁醇的菌種，優(yōu)化發(fā)酵條件，并嘗試少量加入煙酰胺，考察其對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響，為合理利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)可再生能源、增加丁醇產(chǎn)量提供試驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

丙酮丁醇梭菌zzu-02(Clostridium acetobutylicum zzu-02)由鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院生物化工實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與優(yōu)化，在玉米醪(玉米淀粉與去離子水的質(zhì)量比為1∶20，下同)中培養(yǎng)成孢子，4℃保存.

拜氏梭菌zzu-01(Clostridium beijerinckii zzu-01)由鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院生物化工實(shí)驗(yàn)室保存，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)成孢子，4℃保存.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)原料

玉米秸稈，取樣于河南省南陽市郊區(qū)試驗(yàn)田(長(zhǎng)50m，寬80 m)，將水蒸氣通入密閉的放有自然風(fēng)干的玉米秸稈(莖稈切成1～3cm的小塊)的汽爆罐，迅速升高罐壓至1.5MPa，5min后，迅速降壓，制得汽爆玉米秸稈(纖維素含量32.3%，半纖維素含量16.0%)，備用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

丙酮丁醇梭菌zzu-02種子培養(yǎng)基:市售玉米淀粉直接高壓滅菌(0.1MPa，121℃，15 min)，pH= 6.3，使用去離子水配制成玉米淀粉與去離子水質(zhì)量比為1∶20的玉米醪.

拜氏梭菌zzu-01種子培養(yǎng)基:牛肉胰酶消化液500.0mL，牛肉浸液500.0mL，氯化鈉5.0g，葡萄糖5.0g，瓊脂1g，硫乙醇酸鈉0.5g，碎肉渣10g，pH= 7.2～7.4.

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母抽提物0.8 g，磷酸二氫鉀0.5g，乙酸胺6 g，煙酰胺0.25 g，秸稈酶解液1 L，pH=6.3.

1.2.2 種子液的制備

取保存于冰箱中的丙酮丁醇梭菌zzu-02孢子，接種到玉米醪培養(yǎng)基中(接種后丙酮丁醇梭菌zzu-02孢子液體積分?jǐn)?shù)為6%)，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)25h.

取保存于冰箱中的拜氏梭菌zzu-01孢子，接種到種子培養(yǎng)基中(接種后拜氏梭菌zzu-01孢子液體積分?jǐn)?shù)為6%)，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)28h.

1.2.3 菌株的篩選

將兩種不同的菌種分別接種于篩選的培養(yǎng)基中，待發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢測(cè)丁醇產(chǎn)量，丁醇產(chǎn)量高的菌株被選為實(shí)驗(yàn)用菌株.

1.2.4 丁醇發(fā)酵的優(yōu)化

由于秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，經(jīng)酶解后酶解液上清液的主要成分是糖，添加一些供菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，才能使菌體正常生長(zhǎng)發(fā)酵.文中除了考察菌種、初始pH值，酶解液糖濃度對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響，還通過正交試驗(yàn)考察為菌體生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)元素的乙酸銨(A)、酵母膏(B)、磷酸二氫鉀(C)和煙酰胺(D)對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次.正交試驗(yàn)因素水平如表1所示.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液發(fā)酵

將300mL的發(fā)酵培養(yǎng)基裝在500 mL的三角瓶里，制備好的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種后種子液的體積分?jǐn)?shù)為6%)，38℃恒溫培養(yǎng)70h.

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)［16-17］中的 DNS法測(cè)定還原糖含量.

1.3.2 丁醇含量測(cè)定

在上海析默分析儀器有限公司生產(chǎn)的GC7980型氣相色譜儀上用氣相色譜法測(cè)定丁醇含量.采用毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度220℃，F(xiàn)ID溫度230℃，柱溫70℃，運(yùn)行時(shí)間6min;程序不升溫，不分流，進(jìn)樣量1μL;H2流速30mL/min，空氣流速300mL/min，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇.

1.3.3 轉(zhuǎn)化率計(jì)算

丁醇和總?cè)軇?丙酮、丁醇和乙醇)的轉(zhuǎn)化率按下式計(jì)算:

式中，丁醇產(chǎn)量、總糖和殘?zhí)呛繂挝痪鶠間/L.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

溶劑的主要成分是丁醇，因此菌株篩選的主要依據(jù)是丁醇的產(chǎn)量.通過分析發(fā)酵后丁醇的產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，丙酮丁醇梭菌zzu-02和拜氏梭菌zzu-01發(fā)酵還原糖含量為52 g/L的水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液時(shí)，丁醇產(chǎn)量分別為6.925、5.238 g/L，丙酮丁醇梭菌的丁醇產(chǎn)量明顯高于拜氏梭菌，原因可能是高濃度的碳源對(duì)拜氏梭菌有明顯的抑制作用［18］.因此優(yōu)選丙酮丁醇梭菌zzu-02作為試驗(yàn)用菌株.

2.2 酶解液糖含量對(duì)溶劑產(chǎn)量的影響

丁醇生產(chǎn)中的一個(gè)重要影響因素是生產(chǎn)強(qiáng)度.要提高生產(chǎn)強(qiáng)度，需在產(chǎn)物不抑制和產(chǎn)率不下降的情況下，盡可能提高發(fā)酵液中的糖含量.汽爆玉米秸稈與去離子水的質(zhì)量比為3∶20的混合液經(jīng)酶解后，離心，取其上清，糖含量為57.5g/L，糖含量較低.發(fā)酵后殘?zhí)呛康停f明發(fā)酵液中的糖基本用完.為提高糖含量，嘗試將秸稈酶解上清液，分別濃縮至原液的75% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)，余同)、67%和50%，濃縮后糖含量分別達(dá)到76.7、86.3和115.0g/L.不同濃縮液經(jīng)發(fā)酵后的溶劑產(chǎn)量如圖1所示.不同濃縮度的濃縮液發(fā)酵前后的還原糖含量如表2所示.

由圖1可見:不同濃縮液經(jīng)發(fā)醇后，丁醇產(chǎn)量和總?cè)軇┊a(chǎn)量差異較大;酶解原液丁醇產(chǎn)量和總?cè)軇舛茸罡?酶解上清原液濃縮度越大，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量越小.

同時(shí)，由表2可見，酶解上清原液濃縮度越大，發(fā)酵時(shí)被消耗的糖越少.這說明汽爆玉米秸稈酶解后，有抑制菌種生長(zhǎng)的物質(zhì)存在.隨著濃縮液濃度的提高，雖然糖含量提高了，但抑制物的含量也提高了，所以當(dāng)酶解上清液質(zhì)量濃縮到原液的50%時(shí)，發(fā)醇后丁醇的產(chǎn)量?jī)H為1.13 g/L.故要想進(jìn)一步提高生產(chǎn)強(qiáng)度，首先要做好秸稈酶解前的預(yù)處理.酶解過程中抑制丁醇生成的物質(zhì)主要是甲酸和糠醛等，酶解前通過水洗預(yù)處理秸稈降低甲酸和糠醛的含量，可提高丁醇產(chǎn)量.

圖1 不同濃縮液經(jīng)發(fā)酵后的溶劑產(chǎn)量Fig.1 Solvent yield of fermentated liquid with different concentrations

表2 不同濃縮度的濃縮液發(fā)酵前后的還原糖含量Table 2 Reducing sugar concentrations before and after fermentation of concentrated liquid with different concentration ratios

2.3 初始pH值及菌液接種量對(duì)溶劑產(chǎn)量的影響

影響丁醇產(chǎn)量的另一個(gè)關(guān)鍵因素是初始pH值，過低的初始pH值不利于菌體生長(zhǎng).普通的分批發(fā)酵分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期，當(dāng)pH值降到一定值時(shí)，發(fā)酵液才會(huì)開始產(chǎn)生溶劑.所以過高的初始pH值不利于溶劑的生成.隨菌種發(fā)酵原料和發(fā)酵條件的不同，誘導(dǎo)溶劑產(chǎn)生的pH值范圍也有所不同.經(jīng)脫毒后的水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液的pH值范圍為5.95±0.05，通過氨水調(diào)節(jié)pH值，考察水蒸氣爆破玉米秸稈發(fā)酵時(shí)獲得最高丁醇產(chǎn)率的最適初始pH值.研究了初始pH值為5.9～7.0的水蒸氣爆破玉米秸稈的發(fā)酵情況，結(jié)果如圖2所示.由圖2可見，在這個(gè)范圍內(nèi)，丁醇產(chǎn)量相差不大，初始pH值為6.3時(shí)丁醇產(chǎn)量略高一些.

圖2 初始pH值對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of initial pH value on butanol yield

菌液接種量(接種后菌液的體積分?jǐn)?shù))對(duì)丁醇產(chǎn)量也有一定的影響，不同接種量下的丁醇產(chǎn)量如圖3所示.由圖3可見，丁醇產(chǎn)量隨著接種量的增大逐漸增加，接種量增加到6%后，丁醇產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，因此選擇6%作為發(fā)酵接種量.

圖3 菌液接種量對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of microbial inoculation quantity on butanol yield

2.4 營(yíng)養(yǎng)元素添加量對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響

不同的營(yíng)養(yǎng)元素添加量下，酶解液中丁醇的產(chǎn)量如表3所示.

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of L9(34)orthogonal test

由表3所示結(jié)果可知，各因素對(duì)丁醇產(chǎn)量的影響程度為:A＞C＞B＞D，其中乙酸銨對(duì)丁醇產(chǎn)量影響最大.分析發(fā)現(xiàn)，A2B3C1D2為最佳方案，該條件下酶解液中丁醇濃度為9.726g/L.

以Clostridium beijerinckii為菌種、酵母膏為菌體營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，小麥稈水解液中溶劑生成率可以達(dá)到0.6g/(L·h)［19］.酵母膏也適合于丙酮丁醇梭菌zzu-02對(duì)水蒸氣爆破玉米秸稈的發(fā)酵.添加乙酸銨，不僅為丙酮丁醇梭菌在秸稈酶解液中的生長(zhǎng)提供了氮源，而且乙酸是ABE發(fā)酵中重要的化合物，與產(chǎn)酸過程和產(chǎn)溶劑過程中酶的有效表達(dá)有關(guān)系［20］，所以適量的乙酸胺有利于發(fā)酵，可提高丁醇產(chǎn)量和糖的利用率.微量營(yíng)養(yǎng)元素中，K+是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，當(dāng)K+濃度為零時(shí)，發(fā)酵不產(chǎn)生溶劑，只能產(chǎn)酸，隨著K+濃度增大，溶劑產(chǎn)量也增大，但是當(dāng)K+濃度增加到一定值時(shí)，溶劑產(chǎn)量保持不變，不會(huì)再增加［21］，所以適量的磷酸二氫鉀不僅提供了磷源，也提供了K+，有利于提高溶劑產(chǎn)量.

煙酰胺是形成輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和輔酶NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的組成成分，二者是各種脫氫酶的輔酶.這兩種輔酶結(jié)構(gòu)中的煙酰胺部分具有可逆的加氫與脫氫特性，在許多生物氧化、還原反應(yīng)中起傳遞電子和質(zhì)子的作用［22］.丁醇的代謝途徑中，從乙酰輔酶A到丁醇的過程中，伴隨著氧化還原反應(yīng)，有4種脫氫酶(3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶)的參與，所以少量煙酰胺能促進(jìn)代謝，有助于丁醇的生成.

2.5 優(yōu)化條件試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

在最佳的發(fā)酵條件下，將水蒸氣爆破玉米秸稈與其他幾種糖原料(玉米淀粉、米糠酶解液和葡萄糖)發(fā)酵后的溶劑產(chǎn)量進(jìn)行了比較，從而檢驗(yàn)最佳發(fā)酵條件的可靠性，結(jié)果如表4所示.

表4 不同原料經(jīng)Clostridium acetobutylicum zzu-02發(fā)酵后的溶劑產(chǎn)量Table 4 Solvent yield from different raw materials fermented by Clostridium acetobutylicum zzu-02

由表4可見，丙酮丁醇梭菌zzu-02發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈、米糠酶解液、玉米淀粉，丁醇產(chǎn)量都在10g/L左右，水蒸氣爆破玉米秸稈生產(chǎn)丁醇的產(chǎn)量?jī)H次于玉米淀粉，略高于米糠.該結(jié)果說明優(yōu)化后的條件適合于Clostridium acetobutylicum zzu-02發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈生產(chǎn)丁醇.

3 結(jié)論與展望

文中篩選出了一株能發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈而且丁醇產(chǎn)量高的菌株 Clostridium acetobutylicum zzu-02，經(jīng)過優(yōu)化與檢驗(yàn)，確定了該菌株發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈生產(chǎn)丁醇的最佳條件如下:水蒸氣爆玉米秸稈酶解液糖含量57.5 g/L、初始pH值6.3，發(fā)酵液接種量6%，發(fā)酵溫度37℃，酵母膏、乙酸銨、磷酸二氫鉀、煙酰胺的添加量分別為0.8、6.0、0.5、0.25g/L，該條件下丁醇產(chǎn)量達(dá)到9.726g/L.根據(jù)丁醇的代謝途徑，加入少量煙酰胺能有效促進(jìn)丁醇的生成.以玉米秸稈為原料生產(chǎn)丁醇，這對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物再利用、農(nóng)民增收以及提供清潔能源具有多重意義.但與糧食、木薯、菊竽相比，秸稈在酶解后，酶解液中還原性糖的濃度偏低，需要進(jìn)一步提高，秸稈酶解前的脫毒技術(shù)也待繼續(xù)深入.圍繞提高發(fā)酵終點(diǎn)總?cè)軇┲械亩〈急壤岸〈紳舛?，仍需要開展大量的研究工作.

［1］ Guo T，Tang Y，Zhang Q Y，et al.Clostridium beijerinckii mutant with high inhibitor tolerance obtained by low-energy ion implantation［J］.Journal of Industrial Microbiology Biotechnology，2012，39(3):401-407.

［2］ Peter Dürre.Butanol:an attractive biofuel［J］.Biotechnology Journal，2007，2(11):1525-1534.

［3］ Lee S Y，Park J H，Jang S H.Fermentative butanol production by Clostridia［J］.Biotechnology Bioengeering，2008，101(2):209-228.

［4］ Chiao Juishen，Sun Zhihao.History of the acetone-butanolethanol fermentation industry in China:development of continuous production technology［J］.Journal of Molecular Microbiology Biotechnology，2007，13(1):12-14.

［5］ Jones D T，Woods D R.Acetone-butanol fermentation revisited［J］.Microbiol Rev，1986，50(4):484-524.

［6］ Ejeji T C，Qureshi N，Blaschek H P.Acetone-butanol-ethanol production from concentrated substrate:reduction in substrate inhibition by fed-batch technique and product inhibition by gas stripping［J］.Applied Microbiology Biotechnollogy，2004，63(6):653-658.

［7］ 姜岷，韋萍，盧定強(qiáng)，等.后化石經(jīng)濟(jì)時(shí)代工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的若干思考［J］.化工進(jìn)展，2006，25(10): 1119-1123.Jiang Min，Wei Ping，Lu Ding-qiang，et al.Considerations on the development of industrial biotechnology of post-petroleum epoch［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2006，25(10):1119-1123.

［8］ Qureshi N，Saha B C，Hector R E C.Production of butanol (a biofuel)from agricultural residues(PartⅡ):use of corn stover and switchgrass hydrolysates［J］.Biomass and Bioenergy，2010，34(4):566-571.

［9］ Qureshi N，Saha B C，Dien B，et al.Production of butanol (a biofuel)from agricultural residues(PartⅠ):use of barley straw hydrolysate［J］.Biomass and Bioenergy，2010，34(4):559-565.

［10］ Sun Z，Liu S.Production of n-butanol from concentrated sugar maple hemicellulosic hydrolysate by Clostridia acetobutylicum ATCC824［J］.Biomass and Bioenergy，doi:10.1016/j.biombioe.2010.07.026.

［11］ Qureshi N，Li X L，Hughes S.Butanol production from corn fiber xylan using Clostridium acetobutylicum［J］.Biotechnology Progress，2006，22(3):673-680.

［12］ Ezeji T，Qureshi N，Blaschek H P.Butanol production from agricultural residues:impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation［J］.Biotechnology Bioengineering，2007，97 (6):1460-1469.

［13］ 王鳳芹，原歡，楚樂然，等.玉米秸稈水解液燃料丁醇發(fā)酵條件優(yōu)化研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36 (10):79-83.Wang Feng-qin，Yuan Huan，Chu Le-ran，et al.Optimization of butanol fermentation condition with corn straw hydrolyze as aaw material［J］.Food and Fermentation Industries，2010，36(10):79-83.

［14］ 林有勝，王競(jìng)，王旭明，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化秸稈水解液的丁醇發(fā)酵條件研究［J］.科學(xué)通報(bào)，2010 (36):3463-3468.Lin You-sheng，Wang Jing，Wang Xu-ming，et al.Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by Clostridium acetobutylicum using response surface method［J］.Chinese Science Bull，2010(36): 3463-3468.

［15］ 陳洪章.水蒸氣爆碎技術(shù)原理及應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:25-30.

［16］ QB 2583—2003，纖維素酶制劑［S］.

［17］ Ghose T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and Applied Chemistry，1987，59(2):257-268.

［18］ Lee S Y，Park J H，Jang S H.Fermentative butanol production by Clostridia［J］.Biotechnology and Bioengeering，2008，101(2):209-228.

［19］ Qureshi N，Saha B C，Cotta M A.Butanol production from wheat straw hydrolysate using Clostridium beijerinckii［J］.Bioprocess Engineering，2007，30:419-427.

［20］ Yang Gu，Shiyuan Hu，Jun Chen.Ammonium acetate enhances solvent production by Clostridium acetobutylicum EA2018 using cassava as a fermentation medium［J］.Microbiology Biotechnology，2009，36(10):1225-1232.

［21］ Monot F，Martin J，Petitdemange H，et al.Acetone and butanol production by Clostridium acetobutylicum in a synthetic medium［J］.Applied and Environmental Microbiology，1982，44(6):13-18.

［22］ 沈同，王鏡巖.生物化學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，1992:369-370.