焦 磊譯，劉慧霞校對(duì)

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

用甘蔗汁生產(chǎn)丁醇的試驗(yàn)研究

焦 磊譯，劉慧霞校對(duì)

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

丁醇是分子式為C4H90H的一種飽和脂肪醇，它可用作運(yùn)輸燃料，以及各種化學(xué)應(yīng)用中的介質(zhì)和溶劑。20世紀(jì)50年代以前，丙酮丁醇發(fā)酵一直是工業(yè)上生產(chǎn)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)方法?，F(xiàn)代微生物的技術(shù)已經(jīng)改造了生產(chǎn)菌，使之能夠產(chǎn)出更高純度的丁醇，而不是產(chǎn)出以前那種混合溶劑。丁醇作為一個(gè)代用燃料來源有許多優(yōu)勢(shì)：一是更高的能量；二是能夠在現(xiàn)有管道中運(yùn)輸使用；三是容易和汽油相互混合。丁醇能夠從甘蔗汁，糖蜜或者蔗渣水解液中的糖中生產(chǎn)出來，這主要是通過一系列拜式梭菌發(fā)酵蔗糖而實(shí)現(xiàn)。甘蔗汁和糖蜜能夠直接發(fā)酵生成丁醇，糖蜜發(fā)酵丁醇的產(chǎn)量為0．30g/g，甘蔗汁發(fā)酵丁醇的產(chǎn)量為0．34g/g，而在等量的蔗糖濃度下每克蔗糖產(chǎn)出0．27克丁醇。從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來看，從甘蔗產(chǎn)品中生產(chǎn)丁醇的方法是可行的。

生物量；丁醇；發(fā)酵；甘蔗汁

0 前言

通過丙酮丁醇梭桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇是我們所知的最古老的一種工業(yè)發(fā)酵方法之一。其生產(chǎn)規(guī)模僅次于酒精酵母發(fā)酵，而且是所知最大的生物技術(shù)過程之一。1950年以前，工業(yè)溶劑丙酮，丁醇和異丙醇都是通過發(fā)酵而來的（見圖1）。

圖1 丙酮丁醇發(fā)酵工廠

按照以往發(fā)酵丁醇的方法，兩種梭菌種類丙酮丁醇梭桿菌或者丁酸桿菌被選擇為發(fā)酵菌種。在典型的丙酮丁醇發(fā)酵中，丁酸，丙酸，乳酸和乙酸首先生成，培養(yǎng)液的pH下降，培養(yǎng)菌經(jīng)歷一系列新陳代謝過程，然后才生成丁醇，丙酮，異丙醇和乙醇。

由葡萄糖生產(chǎn)丁醇的得率較低，一般在15%左右，很少有超過25%的。丁醇的產(chǎn)量受限于嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制。當(dāng)丁醇濃度為1%時(shí)，抑制細(xì)胞的生長和發(fā)酵達(dá)20%。當(dāng)丁醇濃度為1.6%時(shí)，則完全抑制了細(xì)胞的生長和發(fā)酵。傳統(tǒng)丙酮丁醇發(fā)酵的液體培養(yǎng)基中，丁醇的濃度不超過1.3%。

通過發(fā)酵產(chǎn)丁醇重新激發(fā)了人們對(duì)于發(fā)展可再生能源的興趣。丁醇既是一種重要的工業(yè)溶劑，也是一種比乙醇更好的潛在能源（如表1）。

表1 替代燃料的屬性

丁醇作為一種可替代燃料資源具有很多優(yōu)點(diǎn)：一是更高的能含量；二是能夠在現(xiàn)有管道中運(yùn)輸使用；三是容易和汽油混合。由于它的低溶解度，在水存在的情況下，丁醇相對(duì)于乙醇不太容易從混合燃料中分離出來。

從糖類中生產(chǎn)丁醇來自于生化路線，首先葡萄糖生成乙酰輔酶A，同時(shí)有丙酮和丁酸產(chǎn)生，然后丁酸轉(zhuǎn)化為丁醇，通過微生物群，丙酮轉(zhuǎn)化為丙醇。雖然人們嘗試很多方法來改變這些微生物的遺傳性狀，使丙酮從丁醇的生產(chǎn)中分離出來，但是并沒有完全成功，因?yàn)楸投〈际冀K共享一個(gè)共同中間體（如圖2）。通常抑制丙酮的生成也會(huì)使丁醇的產(chǎn)量減少。

圖2 丁醇和丙酮的生化途徑

在過去的二十年左右，人們進(jìn)行了很多工程嘗試來提高丙酮丁醇乙醇（ABE）發(fā)酵中丁醇的產(chǎn)量，包括有細(xì)胞回收和細(xì)胞固定來增加發(fā)酵細(xì)胞的濃度和反應(yīng)堆的生產(chǎn)力，使用萃取發(fā)酵來使產(chǎn)物的抑制最小化。但是發(fā)酵后的丁醇濃度仍然少于2%，生產(chǎn)效率為4.469g/1/h，得率為25%左右。

優(yōu)化丙酮丁醇乙醇（ABE）發(fā)酵過程一直是工業(yè)過程的一個(gè)目標(biāo)。像其他任何一種生物原料一樣，丙酮丁醇乙醇（ABE）發(fā)酵的可行性依賴于原料的成本和微生物的生產(chǎn)能力。如果丁醇能夠從低成本的糖中以較為經(jīng)濟(jì)的手段生產(chǎn)出來，則市場(chǎng)對(duì)丁醇的需求量將會(huì)大大增加。近期很多研究主要集中在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化糖上，以及發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇這一替代能源方面。

很少有報(bào)道將甘蔗糖作為可利用的原料來發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。這一研究的開展是由于我們對(duì)美國路易斯安那州制糖工業(yè)生產(chǎn)生物燃料的興趣引起的。

1 材料和方法

1.1 微生物和種菌制備

本研究使用一系列拜氏梭菌。200μL細(xì)菌孢子在80℃條件下熱沖擊10分鐘后放到冰中冷卻，然后接種到27mL蛋白胨葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基中，在34℃下培養(yǎng)12.16h。

1.2 碳源

本研究使用不同的碳源：實(shí)驗(yàn)室級(jí)蔗糖，赤糖糊，混合汁，以及來源于玉米淀粉的葡萄糖作為對(duì)照。玉米淀粉水解成麥芽低聚糖，經(jīng)淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶生成葡萄糖。酶將95%的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。

1.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵

發(fā)酵是在125ml的螺釘封頂瓶中進(jìn)行的，其中有120ml的培養(yǎng)液，溫度為34℃，沒有攪拌、氣流或者pH控制。培養(yǎng)液包含有蔗糖（5%濃度），糖蜜（含糖5.9%），糖汁（含糖4.9%），或者5%的葡萄糖作為碳源，補(bǔ)充1g/L的酵母浸出液。培養(yǎng)液滅菌以后，過濾消毒原液包括：緩沖液（KH2P04，50g/L；K2HP04，50g/L，乙酸銨220g/L），維生素（對(duì)氨基苯甲酸，0.1g/L；維生素B1，0.19g/L；生物素，0.001g/L），礦物質(zhì)（MgS04-7H20，20g/L；MnS04.H20，1g/L；FeS04.7H20， 1g/L；NaCl，lg/L），每樣添加lmL。同時(shí)接種高度能動(dòng)的菌體細(xì)胞。在發(fā)酵的過程中，采集4mL樣品測(cè)定吸光度、pH、溶劑濃度、有機(jī)酸含量，并進(jìn)行糖品分析。

1.4 分析程序

在600nm的吸光度下可以預(yù)估菌體細(xì)胞濃度。溶劑、丁醇、丙酮、乙醇都是通過氣相色譜來測(cè)定（使用PhenomenexZP waxplus）。有機(jī)酸、乙酸、丁酸都是通過高效液相色譜測(cè)定（使用陰離子交換柱Dionex lonpacAS.11）。糖類則通過高效液相色譜測(cè)定（使用Biorad HPS87K）。

2 結(jié)果和討論

拜式梭菌的生長曲線對(duì)于所有碳源都是相似的，達(dá)到指數(shù)晚期的時(shí)間約為30h，49.5h后達(dá)到最大增長量，無論是加蔗糖還是加葡萄糖的培養(yǎng)液，它們的pH都在指數(shù)晚期以前下降，然后回升。這是一個(gè)典型的拜式梭菌生長模式，反映出產(chǎn)量以及有機(jī)酸的利用。在大多數(shù)ABE培養(yǎng)基中，丁醇在穩(wěn)定期以后開始產(chǎn)生。在整個(gè)發(fā)酵過程中，少量的丙酮和乙醇一直存在，但是糖蜜發(fā)酵是個(gè)例外，丁醇產(chǎn)量在生長期便開始逐漸增加。這種模式表明丁醇通過拜式梭菌連續(xù)高效生產(chǎn)（如圖3）。培養(yǎng)過程中糖蜜能引起酸化，這是因?yàn)樘砑拥奶敲壑杏?.65Brix的乙酸，相對(duì)于其他碳源，這抑制了丁醇的生成。在穩(wěn)定期以后，丁醇的產(chǎn)量逐漸增加。在糖汁的發(fā)酵中，丁醇的產(chǎn)量在12h至49.5h之間快速增加。

糖汁（含4.9%的糖）和糖蜜（5.9%糖）都是發(fā)酵丁醇的優(yōu)良培養(yǎng)基（如圖4）。更高濃度的糖蜜就會(huì)抑制菌體生長，這可能是由于滲透作用所致。在所有情況下，異丙醇是最大的副產(chǎn)品。這個(gè)產(chǎn)物的模式同丁酸桿菌的產(chǎn)物非常相似。在所有的試樣中，都發(fā)現(xiàn)有少量的乙醇。葡萄糖和蔗糖發(fā)酵生成的丁醇沒有什么不同。這兩種發(fā)酵碳源都不是最佳的。在所有的情況下，發(fā)酵完以后仍然有殘?zhí)恰?/p>

糖汁和糖蜜發(fā)酵生成產(chǎn)物的能力要高于蔗糖或葡萄糖。

在碳源的使用方面，它依賴于產(chǎn)物的生成（如表2所示），使用甘蔗原料所產(chǎn)生的溶劑是使用純糖或玉米水解物所產(chǎn)生的溶劑的1.3倍。

圖3 不同碳源對(duì)丙酮丁醇產(chǎn)量的影響（■丙醇，◆丁醇，▲總量）

圖4 在不同的5%單一碳源條件下，發(fā)酵后丁醇、丙醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量（g／L，96.5小時(shí)）

表2 不同碳源的溶劑產(chǎn)量

在所有情況下，首先產(chǎn)生丁醇，并伴隨有相當(dāng)部分的異丙醇。丙酮和乙醇要么缺失，要么微量存在（如表3）。

由于原料的作用不同，溶劑的收益不盡相同，有的差別。比較丁醇發(fā)酵和乙醇發(fā)酵的情況，值得注意的是酒精酵母發(fā)酵有個(gè)理論上的最大收益51%，它將1.65kg的糖轉(zhuǎn)化成lL的乙醇。糖的用量和相關(guān)的發(fā)酵丁醇的原料花費(fèi)列于表4中。

表3 不同碳源的溶劑收益率

表4 生產(chǎn)丁醇所需原料成本估價(jià)

雖然由糖轉(zhuǎn)化成丁醇或丙醇低于轉(zhuǎn)化成乙醇，但是丁醇的熱量值更高，也減少了燃料運(yùn)輸管理的問題，這些都值得人們考慮將它作為燃料來生產(chǎn)。從糖汁中直接生產(chǎn)的丁醇燃料很可能會(huì)與玉米酒精產(chǎn)生競爭，而用糖蜜發(fā)酵丁醇的成本更低?？梢灶A(yù)料，努力改進(jìn)菌株以及工藝將會(huì)使收益提高更多。

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2095-820X（2016）01-05

2016-02-25

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