戴逸楠張慶瑞?姜 奕尹 璐張曉東王恩波陳 洋蔡鑫澤富彥財

二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選尋常型銀屑病皮損差異表達蛋白

戴逸楠1張慶瑞1?姜 奕2尹 璐1張曉東1王恩波1陳 洋2蔡鑫澤2富彥財1

目的: 明確尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris,PV)皮損組織與正常人皮膚中的差異表達蛋白。方法: 收集PV皮損組織及正常人皮膚組織,提取蛋白,進行二維凝膠電泳,選擇在PV皮損組織中明顯差異表達的蛋白點,進行質(zhì)譜和生物信息學分析。結(jié)果: PV患者角質(zhì)層和真皮層二維凝膠電泳鑒別蛋白總數(shù)分別為(1961±21)和(1928±49)個,確定差異表達蛋白30個,其中14個被鑒定分型:包括角質(zhì)1型細胞骨架(K1C10、K1C14、K1C15、K1C16)、角質(zhì)2型細胞骨架(K2C1),肌動蛋白(ARP 3,ACTA,ACTBM),熱休克蛋白(PHB,HSPβ1,CH60),中心體蛋白(CP135),膜聯(lián)蛋白(ANXA4、ANXA5)。結(jié)論: 差異表達蛋白可能在PV的病理形成中起重要作用,是潛在的PV診斷標記物。

蛋白質(zhì)組學； 銀屑??； 二維凝膠電泳

近年來,蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展為尋找銀屑病敏感、特異的標志物提供了一條有效的途徑,1我們采用二維凝膠電泳(two－dimensional electrophoresis,2－DE)對蛋白進行分離,然后利用基質(zhì)輔助激光解析/電離－飛行時間質(zhì)譜(MALDI－TOF－TOF－MS)2,3和生物信息學等技術(shù)進行鑒定,比較PV患者皮損與正常人皮膚蛋白質(zhì)表達的差異,以期為PV發(fā)病機制的研究及治療提供有價值的線索。

1 材料和方法

1.1 材料 標本取自我院皮膚科住院尋常型銀屑病(PV)患者16例,其中男8例,女8例,同時選取性別、年齡與之匹配的20名健康人(門診體檢者)為對照,其中男10名,女10名。

蛋白質(zhì)定量雙向電泳蛋白質(zhì)定量試劑盒(GE公司產(chǎn)品),固相pH梯度干膠條(immobilized phgradientIPG3－10,24 cm),電泳試劑丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、尿素、Tris、SDS及CHAPS(Amresco),2D除鹽試劑盒(2D clean－up)試劑盒(GE)。質(zhì)譜鑒定試劑:二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)(GE)、肽標準品及乙腈(默克)、三氟乙酸(TFA)(SIGMA)、基質(zhì)α－氰基－4－羥基肉桂酸(CCA)及胰蛋白酶(Promiger)。

LEICA激光切割儀(LEICA CTR 6500)、等電聚焦儀(Ettan IpgPphor 3)、大型垂直電泳系統(tǒng)(Ettan DALTsix)、UMAX彩色掃描儀(PowerLook 2100XL)、DeCyder 2D 6.5圖像分析軟件、EttanSpot Picker挖點儀(GE Health care)、飛行質(zhì)譜儀(Autoflex IIIBRUKER DALTONOS)、Flex control 3.0質(zhì)譜信號峰識別軟件、Mascot肽質(zhì)量指紋圖數(shù)據(jù)庫查詢軟件(Matrixscience)。

1.2 方法

1.2.1 提取蛋白 取PV患者皮損和正常人皮膚全層組織,面積為0.5 cm×0.5 cm,生理鹽水清洗后－70℃冰箱保存。冰凍組織切片后(16～18μm厚度)置于LEICA薄膜載玻片,LEICA激光切割儀進行組織切割,分別切取角質(zhì)層組織及真皮層組織,置于0.5 mL離心管。用2D clean－up試劑盒處理樣本,提取蛋白。蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。按蛋白濃度不同提取等量蛋白,分為PV患者真皮層組,PV患者角質(zhì)層組,對照組真皮層組及對照組角質(zhì)層組,分別取各組各100μL樣本,加入凝膠。

1.2.2 雙向凝膠電泳(2D－PAGE) 每塊凝膠上樣100μg蛋白,與水化液(7 mol/L尿素,2 M硫脲,4% CHAPS,0.2%兩性電解質(zhì))混勻,上樣體積為290μL。將IPG膠條(24 cm,pH 3～10,NL)水化后,覆蓋礦物油。等電聚焦程序為30 V 6 h→60 V 6 h→500 V 1 h→1000 V 1 h→8000 V 10 h。等電聚焦后,IPG膠條在SDS平衡液(尿素6 M,2%SDS,0.02%溴酚藍儲備液)中平衡15 min。平衡完成后,將平衡后的IPG膠條置于12.5%的均勻聚丙烯酰胺凝膠上方,膠條端滴加寬范圍的蛋白標記物10μL,SDS凝膠頂部,用無水乙醇封閉并排除氣泡,進行第2向凝膠電泳。電泳參數(shù):功率6 w,直至溴酚藍前沿抵達膠底邊緣為止,總計時20 h。PV患者和對照組的真皮層組及角質(zhì)層組均采用cy3和cy5熒光染色。圖像分析:DeCyder 2D 6.5軟件進行圖像分析軟件分析掃描圖像,進行強度校正、點檢測、背景消減、均一化和匹配等處理。

1.2.3 酶解及質(zhì)譜鑒定 選取圖像分析得到的差異蛋白質(zhì)點,切取這些點,脫色后進行膠內(nèi)酶解,20μg/ L胰酶37℃消化過夜。將提取的肽段溶于以50%乙腈－0.5%三氟乙酸后與等體積飽和基質(zhì)(CCA)混勻,于不銹鋼點靶儀上點樣,風干后質(zhì)譜分析。

1.2.4 蛋白鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢 在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中搜索肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù),搜索引擎為Mascot(http://www.matrixscience.com),數(shù)據(jù)庫選用SwissProt。參數(shù)設(shè)置如下:半胱氨酸為脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl－Cys),可變修飾為氧化(M),每個肽允許有1個不完全裂解位點,肽片段分子量最大容許誤差為±100 ppm。蛋白質(zhì)匹配分數(shù)大于36分時有顯著性(P＜0.05),確定蛋白名稱及功能。

2 結(jié)果

2.1 二維凝膠電泳結(jié)果 用DeCyder 2D 6.5圖像分析軟件分析PV患者和正常人角質(zhì)層和真皮層的二維凝膠電泳結(jié)果,蛋白點顯示了良好的重復性與穩(wěn)定性,鑒別蛋白質(zhì)點數(shù)分別為1969±21和1928±49個。將其中一塊膠設(shè)定為參考膠,組內(nèi)平均匹配率為78.2%和76.3%。根據(jù)匹配的差異表達蛋白點的比值大于2且同組三塊膠圖譜中都出現(xiàn)相同變化的蛋白帶點,視為差異表達蛋白。

表1 PV患者差異表達蛋白質(zhì)譜結(jié)果

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 本研究以PV患者皮損及正常人的角質(zhì)層及真皮層的蛋白為研究對象,對30個在二維凝膠電泳上的差異表達蛋白進行MANLDI質(zhì)譜和生物信息學分析,成功鑒定了14種蛋白,分為以下幾類:1、角質(zhì)1型細胞骨架蛋白(K1C10、K1C14、K1C15、K1C16)；2、角質(zhì)2型細胞骨架蛋白(K2C1)；3、肌動蛋白(ARP3,ACTA,ACTBM)；4、熱休克蛋白(PHB,HSPβ1,CH60)；5、中心體蛋白(CP135),膜聯(lián)蛋白(ANXA4、ANXA5)。其中在PV患者皮損區(qū)角質(zhì)層中高表達的有K2C1、K1C10、K1C16、K1C14、CH60、PHB、ARP3、ACTBM、ACTA、ANAX5、CP135、PHB,低表達的有:K1C15、ANAX4、HSPβ1；PV真皮層低表達的有:K1C16、CP135、ACTA。其中K1C16、CP135、ACTA在PV角質(zhì)層高表達,真皮層低表達(表1)。

3 討論

既往有關(guān)PV患者血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜的相關(guān)研究,可為PV的發(fā)病機制的研究提供一定的科學依據(jù),但是血清蛋白電泳存在血漿中高峰度蛋白對低峰度蛋白掩蓋的缺陷,可能對實驗結(jié)果造成影響。如能直接對PV皮損角質(zhì)層及真皮層的蛋白進行研究,則能避免該影響,使實驗結(jié)果更為準確可靠。本實驗證明多種細胞骨架蛋白(包括K1C10、K1C14、K1C15、K2C1、K1C16)在PV患者皮損角質(zhì)層中高表達。Bhawan等4通過免疫組化染色方法研究PV患者皮損區(qū)、非皮損區(qū)標本及非PV人群正常皮膚標本,發(fā)現(xiàn)PV患者皮損K1C16表達增高,與本實驗相一致,同時發(fā)現(xiàn)在PV患者非皮損區(qū)K1C16表達同樣升高。因此可將K1C16作為監(jiān)測臨床前PV的標記物。K1C15表達不兼容的角質(zhì)形成細胞,K1C15表達基因下調(diào)才可維持活化表型,5故可通過調(diào)控K1C15的表達縮短病程。

膜聯(lián)蛋白家族是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白超家族,其分布于各種組織細胞中,目前認為它通過調(diào)控炎性反應、免疫反應、細胞分化、增殖、凋亡及細胞信號轉(zhuǎn)導等參與細胞各種生命活動。Zimmermann等6通過實驗證實在腎髓質(zhì)腫瘤中ANXA4有可能參與細胞的生長、分化及轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)ANXA4在PV皮損角質(zhì)層中低表達,ANXA4的低表達可導致PV皮損區(qū)棘細胞層增殖失控,造成PV皮損區(qū)表皮角化過度,形成鱗屑。本實驗中ANXA5在PV皮損角質(zhì)層中出現(xiàn)高表達,ANXA5主要表達于子宮頸癌鱗狀細胞細胞質(zhì)中,隨著癌細胞分化從高到低,ANXA5的mRNA水平表達逐漸增高。7隨著PV皮損中ANAX5表達的升高,可能導致該處角質(zhì)層細胞分化降低。

熱休克蛋白是所有活細胞在熱誘導后能產(chǎn)生的一種高度保守性的蛋白質(zhì)。正常時在細胞中發(fā)揮重要的生理功能,應激時呈高表達,起到應激保護作用。熱休克蛋白表達的增加能抑制紫外線誘導的細胞凋亡和皮膚炎癥反應。本實驗中PV患者皮損角質(zhì)層中HSP60表達升高,Ishihara8和Hayashi等9均證實掌跖膿皰病患者血清中炎癥性淋巴細胞可與HSP60產(chǎn)生免疫級聯(lián)反應,從而增加PV發(fā)病率。

本研究成功利用蛋白質(zhì)組學技術(shù),建立了PV蛋白標志物的研究平臺,初步篩選出K1C10、K2C1、ARP3、ANXA4、ANXA5、HSP60等有可能作為PV標志物的蛋白,進一步為研究PV的發(fā)病機制及免疫治療提供有價值的線索。

1Rana A,MinzRW,AggarwalR,etal.A comparative proteomic study of sera in paediatric systemic lupus erythematosus patients and in healthy controls using MALDI－TOF－TOF and LC MS－A pilot study.Pediatr Rheumatol Online J,2012,10(1):24.

2孫仁山,陳曉紅,胡建明.蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析銀屑病皮損組織中的蛋白質(zhì)表達.現(xiàn)代醫(yī)學,20l0,38(2):l44－147.

3尹國華,范星,張開明.體外研究銀屑病患者外周血T淋巴細胞對角質(zhì)形成細胞Ki67、C－Myc及Bcl－xL蛋白表達的影響.中國免疫學雜志,2006,22(12):1150－1157.

4Bhawan J,Bansal C,Whren K.K16 expression in uninvolvedpsoriaticskin:a possiblemarker of pre－clinicalpsoriasis.JCutan Pathol,2004,31(7):471－476.

5Waseem A,Dogan B,Tidman N,et al.Keratin 15 expression in stratified epithelia:downregulation in activated keratinocytes.J Invest Dermatol,1999,112(3):362－369.

6 Zimmermann U,Balabanov S,Giebel J.Increased expression and altered location of annexin IV in renal clear cell carcinoma: apossible role in tumour dissemination.Cancer Lett,2004,209 (1):111－118.

7王立平,李欣,許倩.膜聯(lián)蛋白A5在人宮頸鱗癌不同分化型的表達及臨床意義.天津醫(yī)藥,2012,40(7):648－650.

8 Ishihara K,Ando T,Kosugi M.Relationships between the onset of pustulosis palmaris et plantaris,periodontitis and bacterial heat shock proteins.Oral Microbiol Immunol,2000,15(4):232－237.

9 Hayashi M,Fujihara K,Beder LB.Pathogenic role of tonsillar lymphocytes in associated with HSP60/65 in Pustulosis palmaris et plantaris.Auris Nasus Larynx,2009,36(5):578－585.

(收稿:2013－06－30 修回:2013－10－24)

Identification of differentially expressed p roteins in psoriasis vulgaris using two－dimensional electrophoresis and mass spectrometry

DAIYi-nan,ZHANG Qing-rui,JIANG Yi,et al.People's Liberation Army No.202 Hospital,Shenyang, 110003

Objective:To identify the differentially expressed proteins in psoriasis vulgaris(PV)lesions and normal human skin tissue to propose potential pathologicalmarkers in psoriasis vulgaris.Methods:PV lesions and normal human skin tissues were collected and the proteins were extracted.And then,the proteins were resolved by immobilized pH gradient－based two－dimensional electrophoresis(2－DE).The differentially expressed proteinswere analyzed bymatrix－assisted laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry(MALDI－TOF－TOF－MS)and bioinformation.Results:Well－resolved 2－DE profiles of the epidermal and dermal layer were obtained,and average protein dotswere(1969±21)and(1928±49)respectively；30 differentially expressed proteinswere identified,14 ofwhich were well characterized,including keratin type I, actin,heat shock protein,centrosomal protein and annexin.Conclusion:The differentially expressed proteins may play an important role in the pathogenesis of psoriasis and may be potential biomarkers in the diagnosis of PV.

proteomics；psoriasis；two－dimensional electrophoresis

遼寧省自然基金(編號:20102242)

1中國人民解放軍第202醫(yī)院皮膚科,沈陽,110003

2中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室,沈陽,110000

?通信作者