王 強(qiáng),王旭峰,楊金蘭,陳培基,楊宏亮,黎智廣,李劉冬
(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東廣州510300)
直接競爭ELISA法快速測(cè)定水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮類藥物
王 強(qiáng),王旭峰,楊金蘭,陳培基,楊宏亮,黎智廣,李劉冬*
(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東廣州510300)
采用過碘酸鈉法將抗環(huán)丙沙星單克隆抗體(MAb-CIP)與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗體MAb-CIP-HRP,建立了檢測(cè)水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮類藥物殘留的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法(dcELISA),考察了包被原濃度、競爭反應(yīng)時(shí)間和有機(jī)溶劑等因素對(duì)方法靈敏度的影響。結(jié)果表明:在優(yōu)化的反應(yīng)條件下,所建立的dcELISA針對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和雙氟沙星6種氟喹諾酮類藥物的檢測(cè)限(LOD)均不超過0.5ng/mL,線性范圍(IC20~I(xiàn)C80)在1.0~12.1ng/mL之間;對(duì)蝦、鰻鱺和鯽魚三種水產(chǎn)樣品中添加5.0、10.0和20μg/kg時(shí),加標(biāo)回收率為70.4%~104.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%~14.7%;本方法可用于水產(chǎn)品中氟喹諾酮類(FQs)藥物多殘留的快速測(cè)定。
氟喹諾酮,抗體,直接競爭ELISA,水產(chǎn)品
氟喹諾酮類抗生素(Fluoroquinolones,F(xiàn)Qs)是在萘啶酸結(jié)構(gòu)上7位引入哌嗪環(huán),6位引入氟原子后得到的衍生物,屬于第三代喹諾酮類抗菌藥物[1]。該類藥物可治療和預(yù)防細(xì)菌感染,具有高效、低毒、組織穿透力強(qiáng)、抗菌譜廣和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。近年來,F(xiàn)Qs類藥物被廣泛應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè),由此造成的藥物殘留問題日益突出。研究表明,動(dòng)物性食品中殘留低濃度的FQs類藥物容易誘導(dǎo)致病菌對(duì)其耐藥性增強(qiáng),并具有潛在致畸、致癌、致突變作用[4]。為了加強(qiáng)對(duì)FQs類藥物殘留的監(jiān)控管理,我國及其他多個(gè)國家地區(qū)和組織對(duì)其最高殘留限量進(jìn)行了限定[1,5]。
目前檢測(cè)動(dòng)物源性食品中FQs類藥物的殘留方法主要有高效液相色譜—熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)[6],液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[7],高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)[8]等以色譜分離為基礎(chǔ)的儀器方法,其分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適用于藥殘檢測(cè)結(jié)果的定量分析,但存在操作復(fù)雜、前處理繁瑣和設(shè)備昂貴等問題,限制了其廣泛應(yīng)用于大批量樣本的快速分析。近年來,基于抗原抗體反應(yīng)的多殘留酶免疫吸附分析方法(ELISA)以其廣譜特異性、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn),成為獸藥抗生素殘留快速篩查的研究熱點(diǎn)[9-10]。Wang等[1]建立了間接競爭ELISA檢測(cè)動(dòng)物源性食品中6種FQs類藥物殘留,平均回收率為60.0%~93.0%。Emmanuella Uwamahoro[11]和楊正濤等[12]分別建立了檢測(cè)11種和4種FQs類藥物的多殘留間接競爭ELISA,但其僅用于標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)試,均未應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)。目前關(guān)于FQs類藥物多殘留直接競爭ELISA的研究甚少,因此本研究旨在通過制備酶標(biāo)抗體,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了檢測(cè)水產(chǎn)品中6種FQs類藥物多殘留的直接競爭ELISA,進(jìn)一步豐富多殘留免疫分析法的實(shí)際應(yīng)用,為保障我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供一種有效的技術(shù)手段。
1.1 材料與儀器
環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%)和辣根過氧化物酶(HRP) 美國Sigma公司;培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95.5%) 德國Dr. Ehrenstorfer公司;抗環(huán)丙沙星單克隆抗體MAb-CIP、包被原CIP-OVA 本實(shí)驗(yàn)室制備;包被液、PBS緩沖液、封閉液、TMB底物液、底物緩沖液等ELISA所需試劑 均按文獻(xiàn)[13]方法配制;辛酸、硫酸銨、過碘酸鈉(分析純) 廣州化學(xué)試劑廠;魚蝦類樣品 購于廣州市內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);實(shí)驗(yàn)用水 18.2mΩ·cm超純水;其他試劑 均為分析純。
VersaMax酶標(biāo)儀、MultiWashⅢ洗板機(jī) 美國Molecular Devices公司;API3000三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司;Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 酶標(biāo)抗體的制備 采用過碘酸鈉法[14],將辣根過氧化物酶(HRP)與經(jīng)過辛酸—硫酸銨法純化的抗環(huán)丙沙星單克隆抗體(MAb-CIP)偶聯(lián),制備酶標(biāo)抗體MAb-CIP-HRP。
1.2.2 dcELISA檢測(cè)步驟
1.2.2.1 包被 用包被液將包被原CIP-OVA,稀釋至合適濃度,每孔100μL添加到酶標(biāo)板孔中,4℃放置過夜。
1.2.2.2 封閉 用洗滌液洗滌2次,甩干后每孔加入封閉液120μL,37℃溫箱中封閉3h,甩干孔中液體后置于37℃烘箱中烘干備用。
1.2.2.3 加樣 用PBS緩沖液將藥物標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度,將酶標(biāo)抗體MAb-CIP-HRP稀釋3000倍,每孔加入藥物標(biāo)準(zhǔn)液(或待測(cè)樣品)和酶標(biāo)抗體各50μL,輕搖混合,37℃溫箱中孵育反應(yīng)40min后洗滌液洗滌5次,甩干。
1.2.2.4 顯色與測(cè)定 將TMB底物液與底物緩沖液體積比1∶1混合后,每孔100μL添加到板孔中,37℃溫箱中顯色10min后每孔加入50μL終止液終止顯色反應(yīng),酶標(biāo)儀測(cè)定其在450nm處的吸光度(A450nm)。
1.2.2.5 數(shù)據(jù)分析 以藥物標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以B/B0(B為添加藥物時(shí)的吸光值,B0為不添加藥物時(shí)的吸光值)為縱坐標(biāo),使用Origin Pro 7.5軟件四參數(shù)對(duì)數(shù)函數(shù)進(jìn)行曲線擬合,繪制對(duì)應(yīng)的競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算獲得dcELISA的最低檢測(cè)限(LOD,IC10),半抑制濃度(IC50)、線性檢測(cè)范圍(IC20~I(xiàn)C80)等參數(shù)[13]。
1.2.3 方法特異性的評(píng)價(jià) 在最優(yōu)的反應(yīng)條件下,繪制不同藥物的競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線,以交叉反應(yīng)率(CR)評(píng)價(jià)方法的特異性,結(jié)果按式(1)計(jì)算:
1.2.4 樣品提取與凈化 魚類樣品去鱗、去皮,沿背脊取肌肉;蝦去頭、去殼,取肌肉部分。樣品均質(zhì)處理成肉糜狀的待測(cè)試樣。準(zhǔn)確稱取試樣5.0g,置于50mL聚苯乙烯離心管中,加入20mL酸化乙腈(含1%的乙酸),均質(zhì)處理1min,漩渦混合2min,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中。殘?jiān)屑尤?5mL酸化乙腈,重復(fù)提取一次后合并兩次提取液,于45℃下減壓蒸干溶劑。用2mL PBS緩沖液和5mL正己烷充分復(fù)溶,漩渦混合2min后,棄去上層正己烷,用5mL正己烷重復(fù)上述操作一次。移取下層液體并用PBS緩沖液定容至10mL比色管中,取50μL直接用于dcELISA檢測(cè)。
2.1 酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇
本研究采用過碘酸鈉法將HRP表面的糖基氧化成醛基后與單抗MAb-CIP上的氨基進(jìn)行偶聯(lián),制備酶標(biāo)抗體Mab-CIP-HRP。采用直接ELISA法來確定Mab-CIP-HRP的工作濃度,將包被原CIP-OVA包被到酶標(biāo)板上,加入酶標(biāo)抗體孵育反應(yīng),洗滌后加入顯色液,酶催化的顯色液吸光度值與酶標(biāo)抗體含量呈正比[14]。結(jié)果顯示,在包被濃度為0.2μg/mL,Mab-CIP-HRP稀釋度在1/3000時(shí),A450nm在1.4左右,可以滿足免疫分析法的檢測(cè)要求。因此,本研究選擇酶標(biāo)抗體工作濃度為1/3000。
2.2 包被原濃度和競爭反應(yīng)時(shí)間的確定
包被原濃度和競爭反應(yīng)時(shí)間對(duì)ELISA的靈敏度有顯著影響,本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,繪制不同反應(yīng)條件下環(huán)丙沙星的競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線,以Amax/IC50為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)曲線性能,其中Amax為對(duì)應(yīng)曲線的最大吸光值,比值越大則代表靈敏度越高,重復(fù)性越好[15]。由圖1(a)所示,隨著包被原濃度的增加Amax逐漸增加,在最大包被濃度時(shí)IC50顯著升高,說明包被濃度過高時(shí)與酶標(biāo)抗體親和力強(qiáng),不利于游離的小分子藥物競爭反應(yīng),降低檢測(cè)靈敏度。在包被原濃度為0.2μg/mL時(shí)曲線的Amax/IC50最大,因此選擇包被原濃度為0.2μg/mL。同理,由圖1(b)所示,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,Amax趨于平衡,IC50變化不大,反應(yīng)時(shí)間為40min時(shí)曲線的Amax/IC50最大,因此選擇40min為dcELISA競爭反應(yīng)時(shí)間。
圖1 包被原濃度和競爭反應(yīng)時(shí)間對(duì)dcELISA的影響Fig.1 Influence of coating concentration and competitive time on dcELISA
2.3 有機(jī)溶劑甲醇和乙腈對(duì)反應(yīng)的影響
有機(jī)溶劑會(huì)干擾免疫分析中抗原抗體的結(jié)合[16],因此本研究選用兩種實(shí)驗(yàn)中常用的水溶性有機(jī)溶劑甲醇和乙腈,考察其在緩沖體系中的含量對(duì)所建立的dcELISA靈敏度的影響。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)緩沖液中甲醇含量低于5%時(shí),對(duì)dcELISA的靈敏度沒有顯著的影響,進(jìn)一步甲醇含量增加至10%時(shí),曲線Amax和IC50均有小幅度的升高。而隨著緩沖液乙腈含量的增加,曲線Amax不斷下降,IC50不斷升高,靈敏度顯著降低。因此,所建立的dcELISA的緩沖體系中可以耐受5%的甲醇含量,但乙腈含量則需嚴(yán)格控制。
2.4 方法特異性分析
基于前述最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件參數(shù),進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。圖3是經(jīng)Origin Pro 7.5軟件四參數(shù)對(duì)數(shù)函數(shù)擬合后環(huán)丙沙星的dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合度良好并呈典型的S型曲線,IC50為2.1ng/mL。同時(shí),為考察dcELISA的方法特異性,交叉反應(yīng)研究使用了8種結(jié)構(gòu)相似的FQs類藥物和2種水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中常見的抗菌類藥物(氯霉素和孔雀石綠)。結(jié)果如表1所示,dcELISA針對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和雙氟沙星的交叉反應(yīng)率均超過了65%,表明本方法具有寬譜特異性。結(jié)果同時(shí)顯示dcELISA針對(duì)上述6種高交叉反應(yīng)的FQs類藥物的LOD均不超過0.5ng/mL,線性范圍(IC20~I(xiàn)C80)在1.0~ 12.1ng/mL之間,滿足國標(biāo)GB/T 20366-2006和農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》的相關(guān)檢測(cè)要求,可用于這6種FQs類藥物殘留檢測(cè)。
圖2 甲醇和乙腈含量對(duì)dcELISA的影響Fig.2 Influence of concentration of methanol and acetonitrile on dcELISA
圖3 環(huán)丙沙星dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.3 Standard curve of dcELISA for ciprofloxacin(n=3)
表1 dcELISA的靈敏度和交叉反應(yīng)率Table 1 Sensitivity and cross-reactivity for dcELISA
2.5 樣品添加回收測(cè)定
選擇對(duì)蝦、鰻鱺和鯽魚三種水產(chǎn)品進(jìn)行樣品添加回收實(shí)驗(yàn)。向樣品中分別添加5.0、10.0和20μg/kg三個(gè)水平的FQs類藥物標(biāo)準(zhǔn)液,室溫下放置過夜后用1.2.4方法處理,計(jì)算各水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果如表2所示,dcELISA檢測(cè)6種FQs類藥物在三種水產(chǎn)樣品的加標(biāo)回收率為70.4%~104.1%,RSD為5.0%~14.7%,表明本方法準(zhǔn)確度和靈敏度良好,滿足水產(chǎn)樣品中6種FQs類藥物殘留痕量檢測(cè)的要求。
2.6HPLC-MS/MS比對(duì)檢測(cè)
隨機(jī)從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽取魚蝦類水產(chǎn)樣品,將樣品平均分成兩組,一組按照1.2.3方法處理后用于dcELISA檢測(cè)(結(jié)果以環(huán)丙沙星含量來表示),另一組用HPLCMS/MS進(jìn)行檢測(cè),樣品處理方法和儀器參數(shù)設(shè)置參照GB/T 20366-2006,其中HPLC-MS/MS采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。圖4是6種FQs類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM離子流色譜圖(10ng/mL)。比對(duì)檢測(cè)結(jié)果顯示,隨機(jī)抽取了15份水產(chǎn)樣品,其中dcELISA和HPLC-MS/MS針對(duì)一份鯽魚樣品檢測(cè)出環(huán)丙沙星含量分別為8.3μg/kg和7.6μg/kg,其余14份樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性,表明兩種方法結(jié)果相關(guān)度高,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
圖4 6種氟喹諾酮類藥物的MRM離子流色譜圖(10ng/mL)Fig.4 Multiple reaction monitoring chromatogram of six fluoroquinolones(10ng/mL)
針對(duì)具有廣譜性抗菌作用氟喹諾酮類藥物的殘留監(jiān)測(cè),快速準(zhǔn)確的多殘留免疫分析法是一種有效的篩選手段。通過免疫分析法對(duì)樣品進(jìn)行初步篩查,進(jìn)一步通過色譜儀器分析法對(duì)陽性樣品含量進(jìn)行確證分析,有效提高了檢測(cè)工作的效率和準(zhǔn)確度,近年來已逐步成為農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)的主要研究方向。本研究建立了檢測(cè)水產(chǎn)品中6種FQs類藥物殘留的dcELISA方法,方法靈敏度高,滿足相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求,在三種水產(chǎn)品中的加標(biāo)回收率為70.4%~104.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%~14.7%,與HPLC-MS/ MS具有良好的相關(guān)性,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物多殘留的快速測(cè)定。
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表2 水產(chǎn)品中6種氟喹諾酮類藥物的添加回收率(n=3)Table 2 Recovery of six fluoroquinolones from spiked aquatic product(n=3)
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Rapid determination of six fluoroquinolones in aquatic product by direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay
WANG Qiang,WANG Xu-feng,YANG Jin-lan,CHEN Pei-ji,YANG Hong-liang,LI Zhi-guang,LI Liu-dong*
(South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Minisitry of Agriculture;Laboratory of Quality and Safety Risky Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation(Guangzhou),Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China)
In this study,a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay(dcELISA)was developed for rapid determination six fluoroquinolones in aquatic product.Horseradish peroxidase-labelled ciprofloxacin monoclonal antibody(MAb-CIP-HRP)was synthesized by NaIO4method.The effect of coating antigen concentration,competitive reaction time and organic solvents on the sensitivity of dcELISA were investigated. Under the optimized assay conditions,the dcELISA showed the limit of detection below 0.5ng/mL for ciprofloxacin,enrofloxacin,norfloxacin,pefloxacin,sarafloxacin and difloxacin,and the linear range(IC20~I(xiàn)C80)of 1.0 to 12.1ng/mL. Recoveries from spiked shrimp,eel and crucian at levels of 5.0,10 and 20μg/kg were in the range of 70.4%~104.1%,with relative standard deviation ranging from 5.0%to 14.7%.Results indicated that the established dcELISA was suitable for multi-analytes rapid determination of fluoroquinolones residues in aquatic product.
fluoroquinolone;antibody;direct competitive ELISA;aquatic product
TS207.3
A
1002-0306(2014)06-0061-05
10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.004
2013-08-19 *通訊聯(lián)系人
王強(qiáng)(1988-),男,研究實(shí)習(xí)員,研究方向:漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量與安全。
中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2013TS08);農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州)暨廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(KLFQS201202)。