陳乃東，胡 平，羅志強(qiáng)，馬 莉，李望遠(yuǎn)

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，安徽六安237012；3.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽六安237012）

黃酒及其酸敗組分的高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法的研究

陳乃東1，2，3，胡 平1，羅志強(qiáng)1，馬 莉1，李望遠(yuǎn)1

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，安徽六安237012；3.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽六安237012）

黃酒生產(chǎn)與陳化過(guò)程中發(fā)生酸敗變質(zhì)，是黃酒業(yè)面臨的頭等難題。本文中以黃酒原酒為對(duì)象，從檢測(cè)波長(zhǎng)、緩沖液組成、分離電壓等方面對(duì)高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法檢測(cè)黃酒組分的條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)215nm、0.075nmol/L的pH=10.0的磷酸氫二鈉-四硼酸鈉緩沖液、分離電壓8kV檢測(cè)，可以得到理想的黃酒原酒、黃酒料酒與酸敗黃酒原酒的高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜。通過(guò)對(duì)比分析，確定導(dǎo)致酸敗的可能組分峰位于保留時(shí)間27.0～31.0min區(qū)段。研究結(jié)果為黃酒酸敗組分的檢出、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建及黃酒生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

黃酒，高效毛細(xì)管電泳，酸敗

黃酒因酒精含量較低，在生產(chǎn)、陳化和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中易感染細(xì)菌而導(dǎo)致變酸甚至發(fā)臭，這種現(xiàn)象稱為酸敗，俗稱“起醭”。酸敗是我國(guó)黃酒業(yè)面臨的頭等難題[1-2]。輕度酸敗既降低原料出酒率，又損害了黃酒應(yīng)有的風(fēng)味，直接影響了黃酒的品質(zhì)。重度酸敗時(shí)黃酒因變質(zhì)而無(wú)法飲用，造成了大量的人力、物力損失，還會(huì)引發(fā)因清理困難而導(dǎo)致的環(huán)境污染[3-4]。酸敗現(xiàn)象已成為困擾黃酒生產(chǎn)企業(yè)、使黃酒生產(chǎn)成本居高不下的主要技術(shù)難題之一[5]。運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)，建立黃酒酸敗組分檢測(cè)方法進(jìn)而構(gòu)建酸敗預(yù)警機(jī)制對(duì)降低黃酒酸敗的發(fā)生具有重要意義。

在黃酒生產(chǎn)中，多以味道是否變酸、發(fā)臭、目測(cè)是否“起醭”等感官手段判斷黃酒是否發(fā)生酸敗，這種全靠經(jīng)驗(yàn)的做法一旦發(fā)現(xiàn)已是深度酸敗。李勇波[1]、馮德明等[2]運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)黃酒的酸敗組分進(jìn)行了探討，本實(shí)驗(yàn)室[6]在前期實(shí)驗(yàn)也對(duì)酸敗黃酒原酒的酸敗組分HPLC法檢測(cè)條件進(jìn)行了研究，由于發(fā)生酸敗的黃酒pH較低（本實(shí)驗(yàn)使用的酸敗黃酒原酒的pH=1～2），在色譜柱使用允許的pH范圍內(nèi)，酸性較強(qiáng)的酸敗組分多以離子狀態(tài)存在，很難建立有效的酸敗組分檢出HPLC分析方法。

高效毛細(xì)管電泳技術(shù)以毛細(xì)管柱為分離通道，以高壓直流電源為驅(qū)動(dòng)力對(duì)物質(zhì)分子等進(jìn)行高效分離和檢測(cè)[7-8]，由于其進(jìn)樣量少，分析速度快、效率高和樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品等的成分分析、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及質(zhì)量控制[9-12]，在緩沖液為堿性條件下，黃酒的組分尤其是酸敗組分均以離子狀態(tài)存在，在高壓電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管柱中按荷質(zhì)比不同實(shí)現(xiàn)分離。然而高效毛細(xì)管電泳用于黃酒酸敗組分研究尚未見報(bào)道。本文以黃酒原酒為研究對(duì)象，構(gòu)建黃酒組分的HPCE檢測(cè)方法。在此基礎(chǔ)上，對(duì)酸敗的黃酒原酒進(jìn)行對(duì)比分析，確定導(dǎo)致黃酒酸敗的可能組分，為進(jìn)一步探討酸敗的基源、建立預(yù)防黃酒酸敗的質(zhì)量控制方法、對(duì)黃酒釀造的各個(gè)環(huán)節(jié)中建立酸敗預(yù)警系統(tǒng)及黃酒生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硼酸 上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉 南京化學(xué)四試劑一廠；四硼酸鈉 新科電化劑廠；氫氧化鈉 隴西化工股份有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純；黃酒原酒、酸敗黃酒原酒、黃酒料酒 由黃酒原酒加入適當(dāng)?shù)恼{(diào)味品并稀釋而成的直接投入市場(chǎng)銷售的料酒，2012年4月26日從安徽禾裕黃酒集團(tuán)有限公司生產(chǎn)車間隨機(jī)抽取，每種樣品抽取10個(gè)，采回后于4℃冰箱保存、備用。

TU1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析；K1060型高效毛細(xì)管電泳儀 北京凱奧；42.8cm×45μm未涂層石英毛細(xì)管的毛細(xì)管 北京凱奧；精密pH試紙 上海三愛思。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 緩沖液、樣品黃酒原酒、黃酒料酒、酸敗黃酒原酒，測(cè)定前以稀鹽酸、碳酸鈉溶液調(diào)pH=3.0后，以0.45μm纖維素膜過(guò)濾后備用。

1.2.2 毛細(xì)管電泳的條件優(yōu)化

1.2.2.1 電泳緩沖液的選擇 由于黃酒中含有大量的酸性成分，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-10]選擇硼砂、磷酸氫二鈉-四硼酸鈉作為候選緩沖溶液。

1.2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在200～400nm范圍掃描黃酒原酒，獲吸收光譜，進(jìn)而確定HPCE檢測(cè)最佳波長(zhǎng)。

1.2.2.3 分離電壓的選擇 在1.2.2.2確定的波長(zhǎng)下，考察分離電壓為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0kV時(shí)黃酒原酒的HPCE譜，對(duì)比分析，確定適合黃酒組分分析的分離電壓。

1.2.2.4 緩沖溶液pH的選擇 實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定緩沖液的pH分別為8.0、9.0、10.0、11.0時(shí)黃酒原酒HPCE譜，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇適合黃酒組分分離的緩沖液pH。

1.2.2.5 緩沖溶液離子濃度的選擇 在前幾步檢測(cè)的基礎(chǔ)上，考察緩沖液離子濃度對(duì)黃酒組分分離的影響。參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-12]，實(shí)驗(yàn)考察離子濃度為0.025、0.05、0.075、0.1mmol/L時(shí)，黃酒原酒的HPCE譜，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，選擇最佳緩沖液離子濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖體系的選擇

緩沖液體體系測(cè)定結(jié)果見圖1。用硼砂做緩沖液時(shí)，運(yùn)行電流過(guò)大，有漏電現(xiàn)象，基線不穩(wěn)，峰形不好，遷移時(shí)間重現(xiàn)性差。用磷酸氫二鈉-四硼酸鈉緩沖液時(shí)，黃酒各組分分離效果較好，峰面積和遷移時(shí)間的重現(xiàn)性好，基線也很穩(wěn)定。因此選擇磷酸氫二鈉-四硼酸鈉作為緩沖溶液。

圖1 緩沖液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.1 The HPCE graphs detected with different buffers

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

黃酒的200～400nm紫外掃描結(jié)果如圖2所示。

圖2 黃酒原酒的紫外吸收光譜Fig.2 The UV absorption spectrum of wine base

黃酒原酒在200～240nm，250～280nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有較強(qiáng)吸收，另外在365nm附近亦有弱吸收。實(shí)驗(yàn)選擇了215、235、265和365nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。分析檢測(cè)結(jié)果（圖3）可知，檢測(cè)波長(zhǎng)在235、265和365nm時(shí)檢測(cè)不夠靈敏，峰面積較小。綜合考慮，選擇215nm作為黃酒組分分析的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下黃酒原酒的HPCE檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The electrophoretograms of wine base detected with different wavelengths

圖4 電壓對(duì)黃酒原酒組分分離的影響Fig.4 The electrophoretograms of wine base detected with different voltages

2.3 分離電壓的選擇

黃酒原酒在分離電壓分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0kV時(shí)的HPCE測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

分析測(cè)定結(jié)果，黃酒原酒各組分的出峰時(shí)間隨分離電壓的增加而提前。電壓10.0kV時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)電流過(guò)大，引起毛細(xì)管電解質(zhì)產(chǎn)生自熱，柱效明顯下降；分離電壓達(dá)20.0kV時(shí)（圖4），各組分信號(hào)堆疊無(wú)法辨認(rèn)；當(dāng)電壓過(guò)低于7.0kV時(shí)，遷移時(shí)間延長(zhǎng)，譜帶展寬，峰高降低，靈敏度下降。綜合考慮，選擇8.0kV作為分離電壓。

2.4 緩沖溶液pH選擇

由于黃酒中的物質(zhì)多以酸性物質(zhì)為主[13-18]，導(dǎo)致了它在酸性和中性條件下基本不能電離，電泳中的遷移速度與溶劑相等，其吸收峰與溶劑峰重疊，從而使精確度和重現(xiàn)性變差。實(shí)驗(yàn)選擇pH為8.0、9.0、10.0及11.0進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖5）表明，pH為10.0時(shí)，峰形較好，基線正常，峰面積和遷移時(shí)間的重現(xiàn)性好。因此選擇緩沖液的pH為10.0。

圖5 緩沖液pH對(duì)黃酒原酒組分分離的影響Fig.5 The electrophoretograms of wine base detected with different pH values of buffers

2.5 緩沖溶液離子濃度選擇

實(shí)驗(yàn)考察了磷酸氫二鈉的濃度在0.025、0.05、0.075、0.1mmol/L時(shí)的基線、峰形、遷移時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，可見，隨著濃度的增加，基線逐漸漂移，各組分保留時(shí)間延長(zhǎng)；在低濃度時(shí)，峰形有拖尾且峰高逐漸增加的現(xiàn)象，在高濃度時(shí)出現(xiàn)基線漂移；整個(gè)過(guò)程中，遷移時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性都較好。綜合以上因素，選擇緩沖液離子濃度為0.075mmol/L。

圖6 離子濃度對(duì)黃酒原酒組分分離的影響Fig.6 The electrophoretograms of wine base detected with different ion concentration of buffers

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定黃酒組分HPCE分析條件為：pH=10.0的0.075mmol/L磷酸氫二鈉-四硼酸鈉、檢測(cè)波長(zhǎng)215nm、分離電壓8.0kV。在此檢測(cè)條件下，大部分黃酒原酒組分達(dá)到基線分離。

2.6 黃酒原酒、酸敗黃酒原酒原酒、黃酒料酒組分分析

為了驗(yàn)證依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)建立的分析條件的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，采用上述最佳HPCE條件下，測(cè)得黃酒原酒結(jié)果如圖7a所示。在該條件下，黃酒原酒各組分基本實(shí)現(xiàn)基線分離，各組分出峰時(shí)間主要集中在11.0～14.0min（7個(gè)組分峰）和17.0～24.0min（11個(gè)組分峰）。此外，7.0～9.0min之間存在5個(gè)弱峰。多次重復(fù)測(cè)定，檢測(cè)到黃酒原酒的物質(zhì)峰數(shù)量、各組分的保留時(shí)間、峰面積等重現(xiàn)性良好，證明實(shí)驗(yàn)建立的黃酒原酒HPCE檢測(cè)方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好。

同樣條件檢測(cè)黃酒料酒（圖7b），與黃酒原酒對(duì)比分析保留時(shí)間、相對(duì)峰位置、峰形等，在7.0～27.0min具有相同數(shù)量的組分峰，且均為共有峰。主要差別體現(xiàn)在黃酒料酒HPCE譜的37.0～44.0min增加了3個(gè)組分峰，可能是原酒加工成料酒過(guò)程中增加的風(fēng)味組分。黃酒料酒是由黃酒原酒稀釋并加入適當(dāng)?shù)恼{(diào)味組分勾兌而來(lái)，其化學(xué)成分與黃酒原酒基本類似。二者的HPCE譜的相似性進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)建立檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

相同條件下檢測(cè)酸敗黃酒原酒（圖7c），與黃酒原酒對(duì)比分析其保留時(shí)間、相對(duì)峰位置、峰形，在11.0min前，未檢測(cè)到明顯組分峰，在11.0～14.0min只有三個(gè)峰（僅有一個(gè)為共有峰，tR=11.8min），17.0～ 24.0min部分僅有2個(gè)共有峰（tR=22.4min，23.6min）及三個(gè)小峰。在27.0～31.0min間，增加了5個(gè)峰，在tR= 46.3min處，新增了1個(gè)較強(qiáng)的峰。酸敗黃酒原酒與黃酒原酒、黃酒料酒HPCE檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異。酸敗黃酒原酒是在生產(chǎn)黃酒原酒過(guò)程中混進(jìn)有害微生物，其生長(zhǎng)代謝消耗醪液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生導(dǎo)致酸敗的物質(zhì)形成的。因此，酸敗黃酒原酒的HPCE圖中新增的峰包含導(dǎo)致黃酒酸敗的部分或全部物質(zhì)，在11～27.0min內(nèi)缺失的共有峰代表有害微生物發(fā)酵所消耗的組分。生產(chǎn)過(guò)程滅菌不徹底導(dǎo)致有害微生物殘留或侵入是黃酒酸敗的主要原因。建立酸敗黃酒原酒組分高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，可用于黃酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)中監(jiān)控酸敗的產(chǎn)生及黃酒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。此外，可從酸敗醪液中分離純化微生物，采用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法檢測(cè)這些微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)其在27.0～31.0min內(nèi)及46.5min處與酸敗黃酒原酒共有峰的存在與否，追蹤可能導(dǎo)致黃酒酸敗的基源微生物，根據(jù)該微生物的習(xí)性，在生產(chǎn)過(guò)程中改進(jìn)生產(chǎn)工藝，采取針對(duì)性滅菌或預(yù)防措施，抑制有害微生物侵入或生長(zhǎng)，從而有效降低酸敗的發(fā)生，降低黃酒生產(chǎn)成本。本實(shí)驗(yàn)可為這些后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖7 黃酒原酒、黃酒料酒和酸敗的黃酒的組分對(duì)比Fig.7 The HPCE analysis of wine base,marked and rancid Chinese rice wine detected with the established HPCE method

3 結(jié)論與展望

高效毛細(xì)管電泳法可有效檢測(cè)黃酒原酒、黃酒料酒及酸敗黃酒原酒的組分，其最適檢測(cè)條件為：pH=10.0的0.075mol/L磷酸氫二鈉-四硼酸鈉、檢測(cè)波長(zhǎng)215nm、分離電壓8.0kV，在此條件下，可實(shí)現(xiàn)黃酒原酒、黃酒料酒及酸敗黃酒原酒組分的有效分離和檢出。在本實(shí)驗(yàn)確立的最適檢測(cè)條件下，安徽禾裕黃酒有限責(zé)任公司生產(chǎn)中產(chǎn)生的酸敗黃酒原酒在HPCE圖上主要表現(xiàn)為在保留時(shí)間27.0～31.0min內(nèi)及46.5min檢測(cè)到信號(hào)峰，可據(jù)此判斷黃酒或生產(chǎn)某個(gè)環(huán)節(jié)中的醪液是否發(fā)生酸敗。

[1]李勇波，賴櫻花，成堅(jiān)，等.HPLC檢測(cè)客家黃酒酸敗前后有機(jī)酸變化及工藝優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2011（11）：178-182.

[2]馮德明，剝峙清，馬紅霞，等.黃酒酸敗時(shí)主要有機(jī)酸種類及含量分析[J].中國(guó)釀造，2010（1）：125-128.

[3]蔡明迪，陳希，李汴生，等.超高壓處理對(duì)黃酒陳化的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（1）：26-31.

[4]朱一松，趙光鰲，帥桂蘭，等.超濾法生產(chǎn)的純生黃酒非生物穩(wěn)定性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（2）：26-29.

[5]夏艷秋，朱強(qiáng)，汪志君.黃酒醪液酸敗的影響因素及控制[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（7）：33-37.

[6]陳乃東，陳乃富，王慶紅，等.黃酒成分HPLC分析[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，18（13）：177-178.

[7]朱金花，陳興國(guó)，劉繡華.高效毛細(xì)管電泳分離測(cè)定水中的乙酸和氯代乙酸[J].化學(xué)研究，2011，22（2）：56-60.

[8]彭進(jìn)進(jìn)，羅澤嬌，李龍媛.高效毛細(xì)管電泳－二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定土壤中的苯酚[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（1）：98-100.

[9]汪紅，王強(qiáng)，羅輝明，等.丹參多糖的含量測(cè)定及高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定其單糖組分[J].中華中醫(yī)藥·學(xué)刊，2007，25（4）：827-829.

[10]王辰，黃慧玲，莫麗冬，等.腦蛋白水解物中多肽組分的高效毛細(xì)管電泳分析[J].中國(guó)醫(yī)藥，2012，7（5）：603-605.

[11]陳盛余，鄧光輝，張桂華，等.高效毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)法分離檢測(cè)射干苷和鳶尾黃素[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2011，30（3）：80-82.

[12]祝仕清，牛長(zhǎng)群.高效毛細(xì)管電泳法／液質(zhì)聯(lián)用分離與測(cè)控硫酸卷曲霉素各組分[J].中國(guó)抗生素雜志，2009，34（7）：416-418.

[13]呂旭聰，黃志清，黃若蘭，等.反相高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定黃酒和葡萄酒中有機(jī)酸的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（6）：132-136.

[14]鐘其頂，姚亮，熊正河.采用GC/MS和HPLC-ELSD 2種方法測(cè)定黃酒中的EC含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（3）：115-119.

[15]江超，林峰，鄒慧君，等.陳年紹興黃酒的成分分析與品質(zhì)鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（10）：119-123.

[16]江偉，蘭玉倩，黃毅，等.固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)不同酒齡黃酒的微量風(fēng)味分析與應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（2）：144-150.

[17]戴軍，謝廣發(fā)，陳尚衛(wèi)，等.紹興黃酒中一種ACE活性抑制肽的分離和鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（5）：98-101.

[18]俞關(guān)松.黃酒pH指標(biāo)范圍的探討及超標(biāo)的預(yù)防控制[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（1）：76-78.

Study on establishment of HPCE method on the possible rancid constituents of yellow rice wine

CHEN Nai-dong1，2，3，HU Ping1，LUO Zhi-qiang1，MA Li1，LI Wang-yuan1
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Liu’an 237012，China；2.West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine，West Anhui University，Liu’an 237012，China；3.Anhui Biotechnology Research Center of Plant Cell Engineering，Liu’an 237012，China）

Rancidity is a large challenge commonly encountered in Chinese rice wine business.In order to establish a convenient and operable assaying method for detecting main components and rancid constituents of yellow rice wine，HPCE zone electrophoresis was primarily explored involving wavelength，voltage and buffer solution including its kinds，the pH values and the ionic concentration.It was found that ideal electrophoretograms of wine base and its corresponding rancid sample as well as the marketed yellow rice wine could be obtained with wavelength 215nm，0.075nmol/L of disodic phosphate-sodium tetraborate buffer and 8.0kV of separation voltage.The remarkable differences existed between the rancid sample and the other two.These peaks represented potential rancid constituents of metamorphous Chinese rice wine could be determined by the established HPCE method.The result was helpful for the detection of rancid constituents，the establishment of quality standards and the quality control of Chinese rice wine in the future.

yellow rice wine；high performance capillary electrophoresis（HPCE）；rancidity

TS255.1

A

1002-0306（2014）06-0069-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.006

2013－08－05

陳乃東（1972-），男，博士后，副教授，主要從事食品化學(xué)、天然藥物活性成分分離鑒定、中藥與天然藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制方面的研究。

安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2012A277，KJ20108259）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81274021）；安徽省自然科學(xué)基金（090413113）；六安市定向委托皖西學(xué)院市級(jí)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2011LWA001）；皖西學(xué)院研究性學(xué)習(xí)項(xiàng)目（WXXYX2013061，WXXYX2012064，WXXYX2012066）。