朱環(huán)環(huán), 劉艷霞, 潘倩文, 鄭凱倫, 林冬枝,2, 董彥君,2

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海200234; 2.上海師范大學(xué) 植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)中心, 上海 200234)

0 引 言

葉綠體是個(gè)半自主細(xì)胞器,它不僅是光合作用的重要場(chǎng)所,而且還負(fù)責(zé)各種代謝物的生物合成和儲(chǔ)存[1],一個(gè)具有光合活性的葉綠體的生成,需要光、質(zhì)體和核基因組的控制,并伴隨著類囊體膜的產(chǎn)生[2-3].越來(lái)越多的證據(jù)表明,葉綠體的生成是個(gè)高度被監(jiān)管的過(guò)程,包括基因表達(dá),蛋白生物合成以及選擇性的蛋白質(zhì)降解[4].所以,當(dāng)葉綠體的發(fā)育受到阻礙的時(shí)候,會(huì)影響葉綠素合成,從而引起葉色異常[5-6],甚至導(dǎo)致植株死亡[7].很多與葉綠體相關(guān)水稻突變體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),并根據(jù)不同的表型被命名為virescent (v),stripe (st),albino,chlorina,zebra,and yellow-variegated[8].在這些突變體中,v突變體在葉片生長(zhǎng)早期表現(xiàn)為葉綠體不足,在后期生長(zhǎng)中會(huì)產(chǎn)生大部分的綠色葉片[9].St為條紋狀葉片突變體;chl突變體會(huì)產(chǎn)生淡綠色苗,是由于葉綠素的合成出現(xiàn)了問(wèn)題[10];至于zebra和 yellow variegated突變體,發(fā)生后大都不會(huì)導(dǎo)致它們的死亡.而水稻白化苗(albino),葉片一產(chǎn)生就發(fā)生白化,大多數(shù)在三葉期枯死.關(guān)于水稻白化突變體的研究目前也取得一些進(jìn)展,日本的Iwata[12-13]等報(bào)道的11個(gè)水稻白化突變體al1-al11,其突變基因位于第1,4,5,6號(hào)等染色體.夏久成等將一個(gè)返綠的白化突變基因al12,定位在第8染色體上[11].另外,通過(guò)白化致死突變體abl4 對(duì)研究,發(fā)現(xiàn)編碼的ABL4蛋白定位于類囊體膜,推測(cè)ABL4基因是葉綠體正常發(fā)育過(guò)程所必需的[14].余慶波等將水稻白化突變體alb21的突變基因定位在第3染色體,并發(fā)現(xiàn)其葉綠體中只有一些空泡狀結(jié)構(gòu)[15];白化突變體osalb23被定位在第2染色體上[16].鞏孝帝[17]等水稻白化突變體asl1基因定在第1染色體,是編碼核糖體白蛋白基因突變引起.本研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個(gè)水稻白化苗突變體abl25,它的白化致死表型不受溫度影響,對(duì)白化苗突變體的葉色表型、葉綠素水平,葉綠體超微顯微鏡進(jìn)行觀察和分析,并利用了SSR及InDel分子標(biāo)記對(duì)該突變基因進(jìn)行了定位,為該基因的分子克隆及其作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

突變體abl25從粳稻“嘉花1號(hào)”干種子經(jīng)60Coγ射線輻照后代獲得.嘉花種子經(jīng)過(guò)輻照之后發(fā)生突變(Aa),進(jìn)行自交之后選取苗期分離出白化突變體的株系(上一代為雜合單株),隨機(jī)選取4株生長(zhǎng)正常的單株掛牌,收獲掛牌的單株種子播種,根據(jù)后代分離情況確定上一代的基因型,棄純合野生型單株,保留雜合單株.之后,突變體雜合子與秈稻廣占63S雜交,得到F1代種子,自交后得到F2代分離群體,用于遺傳分析與基因定位.

1.2 方 法

1.2.1 突變體的表型觀察

為了進(jìn)一步確定突變體abl25的表型,將突變體雜合子及其野生型嘉花1號(hào)的種子在32 ℃條件下催芽4 d后,播種在裝有水稻土的塑料盆內(nèi),因?yàn)橛泻枚鄿孛舾械耐蛔凅w被報(bào)道,為排除這種溫度差異,將abl25突變體放置在20、24、28、32 ℃的光照培養(yǎng)箱(GXZ智能型,寧波,江南儀器廠)內(nèi),每天12 h光照(光照強(qiáng)度為180 μmol/m2·s)和自然條件(25 ℃)下,進(jìn)行培養(yǎng),觀察突變體及其野生型葉色變化,并對(duì)其進(jìn)行拍照.

1.2.2 葉片光合色素含量的測(cè)定

在上述32 ℃培養(yǎng)條件下,待突變體abl25與野生型嘉花1號(hào)長(zhǎng)至3葉期時(shí),參照沈偉其[18]描述的水稻葉片葉綠素浸提法.具體為取新鮮葉子1 g,加4倍的100%丙酮和少許石英砂進(jìn)行在低溫下研磨,收集勻漿液;倒入10 mL離心管中3000 r/15 min低溫離心后取上清;若離心后沉淀物還呈現(xiàn)綠色則繼續(xù)研磨離心,直至離心后下層無(wú)綠色為止.所有的上清用80%丙酮定容至50 mL,然后測(cè)吸光值.然后使用BECKMANCOULTER-DU720分光光度計(jì)分別測(cè)定470、645、663 nm 3個(gè)波長(zhǎng)下的吸光值,分別計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量,重復(fù)3次,取其均值.

1.2.3 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

取上述在32 ℃條件下生長(zhǎng)3周的野生型與abl25突變體葉片,用2.5%戊二醛和l %四氧化鋨磷酸緩沖液4°下固定5 h后,用50%,70%,80%,95%,100%的乙醇和丙酮梯度下進(jìn)行脫水,逐級(jí)脫5 min,最后用環(huán)氧化樹(shù)脂包埋樣品,切片后,經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后,Hitachi765型透射電鏡進(jìn)行觀察和拍照.

1.2.4 構(gòu)建定位群體

突變體雜合子(ABL25/abl25)與秈稻廣占63S雜交獲得F1種子,收獲單株種子播種,根據(jù)后代分離情況確定上一代的基因型,只保留雜合基因型(ABL25/abl25)的雜交種,獲得能用于遺傳分析F2代群體,選取表現(xiàn)為白化突變的單株提取DNA.

1.2.5 水稻DNA的提取

采用TPS法[19]以及CTAB[20]法,提取親本以及F2代遺傳群體基因組DNA.

1.2.6 基因定位

本研究中,首先選取本實(shí)驗(yàn)室的保存SSR及InDel的分子標(biāo)記檢測(cè)突變體abl25和廣占63S的多態(tài)性,然后選取均勻分布在水稻12條染色體上的有多態(tài)性的引物,然后,隨機(jī)挑選F2中分離出22株白化苗作連鎖分析,確定突變基因在那條染色體上,接著進(jìn)一步擴(kuò)大F2群體進(jìn)行遺傳定位.在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)通過(guò) NCB公布的粳稻日本晴和秈稻9311的全基因組序列的差異InDel 位點(diǎn),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物[引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成](表 2),對(duì)突變基因進(jìn)行進(jìn)一步定位,應(yīng)用MAPMAKER/EXP3.0[21]軟件,構(gòu)建目的基因區(qū)域的遺傳圖譜.PCR反應(yīng)體系包括:100 mmol/L Tris-HCl(pH=9.0)、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、80 mmol/L (NH4)2SO4、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/mLTaq酶和20 ng模板DNA.在Eppendorf 和東勝PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s(退火溫度隨不同引物變化),72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min.反應(yīng)產(chǎn)物用2.5%～3.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像,而對(duì)于多態(tài)性不明顯的引物的PCR產(chǎn)物,用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),銀染之后用冷光源膠片觀察燈觀察,并拍照記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

在20,24,28,32 ℃人工氣候箱條件下以及自然條件下生長(zhǎng)的突變體苗期表型均一致,不論發(fā)芽后首先長(zhǎng)出的葉鞘,還是不完全葉,以及第2、3葉完全為白色,3葉期后,突變體逐漸死亡(圖1),表明突變體abl25葉色的變化不受溫度及其他外部條件所改變,是水稻苗期白化致死突變體.

圖1 abl25突變體的表型

2.2 突變體光合色素的含量變化

為了探究突變體中光合色素含量的變化,測(cè)定了野生型嘉花1號(hào)與突變型abl25的葉綠素,類胡蘿卜素的含量,結(jié)果顯示突變體abl25的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量明顯低于正常水平,與野生型形成鮮明比對(duì)(表1),說(shuō)明突變體中葉綠素的含量明顯降低,可能為葉綠素合成受到的影響而導(dǎo)致.

表1 abl25突變體的光合色素含量 (mg·g-1)

2.3 abl25葉綠體超細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化

通過(guò)透射電鏡觀察野生型嘉花1號(hào)與abl25突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),野生型嘉花1號(hào)的葉綠體密度無(wú)明顯缺陷,可以看到井然有序的類囊體堆疊,而abl25突變體中無(wú)明顯的類囊體堆疊結(jié)構(gòu),只有些空泡結(jié)構(gòu)(圖2).這說(shuō)明葉綠體的發(fā)育受到嚴(yán)重阻礙,導(dǎo)致abl25葉片內(nèi)沒(méi)有正常的葉綠體產(chǎn)生,葉綠素更是無(wú)法正常合成.

2.4 遺傳分析及基因定位

圖2 野生型和abl25突變體葉綠體的超微結(jié)構(gòu)

選取22株F2代白化苗進(jìn)行粗定位分析,發(fā)現(xiàn)水稻第2染色體上的分子標(biāo)記RM424,RM475(圖3)有強(qiáng)烈的偏態(tài)擴(kuò)增,因此,判斷abl25位于第2染色體,然后擴(kuò)大群體198株(圖4A),將該基因定位在ID9047與 ID10317之間,其遺傳距離分別為0.8 和8.4 cM.為了精細(xì)定位目標(biāo)基因區(qū)域,定位群體擴(kuò)大至4700株,將突變基因定位在ID9111到ID9261之間,物理距離約為150 kb(圖4B),并發(fā)現(xiàn)ID9234與突變基因共分離.根據(jù)http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/和 http://rice.plantbiology.msu.edu在該區(qū)間跨越了2個(gè)不重疊的BAC (AP005777.2和AP005631.3)克隆群,預(yù)測(cè)包含23個(gè)候選基因.

圖3 分子標(biāo)記RM424在親本(P1,P2)及22株具有突變表型F2代單株的DNA分離帶型

圖4 突變體基因abl25在水稻第2染色體上的定位

表2 本研究中新發(fā)展的有多態(tài)的分子標(biāo)記

3 討 論

水稻不僅是重要的糧食作物,也是單子葉植物和禾本科的模式植物,水稻葉色突變體,越來(lái)越引起人們的研究興趣,但是只有很少一部分白化突變體能夠從分子水平作出闡釋.比如,水稻白化突變體alb21無(wú)完整的葉綠體結(jié)構(gòu),只是些空泡結(jié)構(gòu),其定位在第3染色體上1520 kb的區(qū)域內(nèi)[14].同樣的,abl4白化致死突變體沒(méi)有成熟的葉綠體結(jié)構(gòu),只有些類似前質(zhì)體的結(jié)構(gòu),以及部分囊泡狀結(jié)構(gòu),定位第4染色體210 kb內(nèi);目前較為詳細(xì)的是對(duì)白化突變體asl1的研究,表明asl1白化突變體是由編碼核糖體白蛋白基因突變引起[17].

到目前為止,與本研究abl25定位于同條染色體的已知突變基因有alb23[15],其葉綠體中無(wú)類囊體及其他顆粒,定位在280 kb的區(qū)間內(nèi);以及gra(t)[22],其在三葉期之前表現(xiàn)為白化苗,三葉期之后漸漸恢復(fù)綠色表型,定位于42.3 kb區(qū)間內(nèi).都與本文研究所確定在ID9111到ID9261之間150 kb內(nèi)的位置完全不同,因此,abl25是一個(gè)新的白化突變基因.通過(guò)對(duì)ID9111到ID9261之間的生物信息學(xué)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)其中共有23個(gè)候選基因,包括功能未知蛋白3個(gè),其余20個(gè)編碼蛋白的基因中,通過(guò)前導(dǎo)肽預(yù)測(cè)顯示有1個(gè)葉綠體基因(LOC_Os02g16250)(http://ipsort.hgc.jp/),查閱水稻基因表達(dá)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/category-select.php)發(fā)現(xiàn)在葉片中高表達(dá)的基因有LOC_Os02g15660,LOC_Os02g15880,LOC_Os02g15900 LOC_Os02g16060,LOC_Os02g16250,通過(guò)對(duì)上述相關(guān)基因測(cè)序?qū)Ρ?顯示在野生型和abl25突變體中沒(méi)有差異,這說(shuō)明上述候選基因可能與abl25白化致死無(wú)關(guān).由于葉綠體自身所含有的蛋白或者定位于葉綠體以外的蛋白都可能影響植物葉綠體的正常發(fā)育[5].因此導(dǎo)致abl25白化致死的真正原因更是難以斷定,有可能不是葉綠體蛋白基因突變引起的.

本研究發(fā)現(xiàn)的abl25突變體,葉綠素和胡蘿卜素的含量大大降低(圖1),葉肉細(xì)胞超顯微電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體葉綠體中無(wú)任何堆疊的類囊體結(jié)構(gòu),葉綠體的形態(tài)不正常(圖2),這都表明突變體的葉綠體形成在葉片發(fā)育過(guò)程中受到嚴(yán)重阻礙,導(dǎo)致葉綠素?zé)o法正常合成.更有趣的,定位過(guò)程發(fā)現(xiàn)在候選目標(biāo)基因所在的9003～9234 kb區(qū)域之間,引物擴(kuò)增的野生型DNA條帶非常清晰,而abl25突變體中暗淡或不清楚,推測(cè)ABL25基因的突變可能會(huì)對(duì)基因組的復(fù)制產(chǎn)生消極影響,影響突變體某些基因DNA的合成,類似現(xiàn)象在水稻virescent(v3)突變體到得證明[8],但對(duì)于abl25來(lái)說(shuō)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證.今后,將在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大定位群體,發(fā)展更多新的分子標(biāo)記,進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行克隆和功能分析,將有助于加深對(duì)水稻苗期白化致死作用機(jī)理的了解.

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